基于单管无细胞转录和自催化信号放大的荧光生物传感器microRNA检测技术

《Biosensors and Bioelectronics》：Single Tube Cell-free Transcription and Autocatalytic Signal Amplification based Fluorescent Biosensor microRNA Detection

本研究开发了一种基于T7 RNA聚合酶的单管等温无细胞生物传感平台，整合了SplintR连接酶介导的模板组装和自催化信号放大技术，无需逆转录、热循环或多酶联用，实现miRNA的高灵敏检测（0.52 pM）和特异性分析，成功应用于临床血清样本检测，为点诊断和液体活检提供新工具。

　　

钱谢|陈明|林振宇

教育部食品安全与生物分析科学重点实验室 福建省食品安全与健康分析与检测重点实验室 福州大学化学学院，中国福建省福州市350116

摘要

无细胞生物传感系统提供了可编程、快速且低成本的分子检测能力，这种技术已广泛应用于核酸检测中，但通常依赖多种酶和独立的扩增步骤，这限制了其应用范围。在本研究中，以miRNA-21作为模型目标，开发了一种单管、等温的无细胞生物传感平台，该平台结合了SplintR连接酶介导的模板组装和T7 RNA聚合酶驱动的产物辅助自催化转录循环。目标miRNA的存在触发了两个DNA探针的连接，形成功能性转录模板，从而通过无细胞系统启动荧光适配体的合成。转录出的适配体再次作为RNA“支架”参与反应，再生新的模板并触发额外的转录循环，从而在恒定条件下实现自催化信号放大。这种一步法流程无需逆转录、热循环或单独的预扩增，大大减少了操作步骤并降低了污染风险。产生的RNA适配体可以与荧光染料结合产生荧光信号，可用于目标定量。该平台的检测限为0.52 pM，线性范围为1 pM–1 μM，并对密切相关的miRNA序列表现出高特异性。该系统已成功应用于临床血清样本中的目标检测，获得了满意的结果。这项工作提出了一种快速、灵敏且易于使用的miRNA定量策略，为即时检测和液体活检应用提供了强大的工具。

引言

合成生物学的最新进展为设计具有卓越精度和多功能性的分子传感系统开辟了新的途径。（French 2019；Pardee等人2016；Tan等人2021）无细胞系统利用纯化的酶组分重构中心法则过程，已成为开发下一代诊断工具的强大平台。（Amalfitano等人2021；Slomovic等人2015；Tinafar等人2019）该领域一个特别有前景的分支是利用RNA聚合酶介导的转录来构建无细胞系统。（Beabout等人2021；de Puig等人）这类以转录为中心的平台由于其所需的酶最少、反应动力学快以及在等温条件下的操作简单性，非常适合即时检测应用。（Gholamalipour等人2018；Karlikow等人2022；Ma等人2022；Tabor和Richardson 1985）在各种RNA聚合酶中，噬菌体T7 RNA聚合酶因其高过程性和对其启动子的特异性而脱颖而出，能够从单个DNA模板生成数千个RNA转录本，并作为信号放大的强大引擎。（Chen等人2024；Jang等人2017；Patino Diaz等人2022）由于其高扩增效率、有限的酶使用量和简单的工作流程，基于T7 RNA聚合酶的无细胞转录成为检测低丰度核酸生物标志物（如microRNAs）的可行策略。（Reid-Bayliss和Loeb 2017；van Bakel等人2008）

miRNAs是小的非编码RNA分子（18-25个核苷酸），在基因表达调控、细胞分化和疾病进展中起着关键作用。（Filipowicz等人2005；Hammond 2015；Jet等人2021；Wei等人2020）它们通过一系列复杂的生物过程调节目标基因的表达水平。（Shang等人2023）miRNA表达的失调与多种疾病有关，尤其是癌症。（He和Hannon 2004；Kalogianni等人2018）因此，快速准确地检测miRNAs对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。利用T7 RNA聚合酶介导的转录放大的无细胞生物传感器在miRNA检测中受到了关注。（Han等人2021；Khoothiam等人2021；Yoon等人2022）然而，该领域推动检测极限的趋势是通过将T7转录与额外的预扩增或信号转导技术（如重组酶聚合酶扩增（RPA）或CRISPR-Cas系统）相结合来增强检测能力。（Guo等人2023；Liu等人2025）尽管这种混合集成可以提高检测性能（例如降低检测限），但它们本质上带来了实际挑战，包括试剂多样性增加、多酶需求、多步骤程序、成本上升以及多酶级联系统中的缓冲液兼容性问题。例如，Ying等人开发了一种称为LRPA-CRISPR的方法，整合了T7 RNA聚合酶、RPA和Cas12a顺式切割技术用于乳腺癌miRNA检测，该方法提高了低丰度目标的检测灵敏度。（Liu等人2025）然而，这种集成需要使用多种酶，可能会增加系统复杂性和成本，并且在缓冲液优化方面也存在挑战。类似地，Qu等人提出了一种结合T7 RNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶和CRISPR-Cas12a的快速灵敏方法，虽然对miRNA分析显示出潜力，但也突出了需要解决额外试剂和操作步骤相关问题的必要性。（Guo等人2023）因此，这种混合集成本质上削弱了无细胞系统的核心优势——简单性、可重复性和一步法稳健性，从而阻碍了其在即时检测中的应用。因此，仍然迫切需要一个能够充分利用T7转录的强大功能同时最小化酶复杂性的简化扩增平台。

在这里，我们提出了一种依赖连接的、单管无细胞转录级联放大平台，将miRNA目标识别转化为产物辅助的自催化信号放大。如图1所示，该检测方法使用两种DNA探针：一种含有茎环T7启动子序列的启动子探针（供体）和一种携带RNA适配体模板的报告探针（受体）。在目标miRNA存在的情况下，这两种探针杂交在一起，通过SplintR连接酶介导的模板导向连接反应形成全长DNA模板。然后T7 RNA聚合酶转录该模板，生成多个RNA适配体。关键的是，每个转录本都携带短辅助结构域，使其能够重新与未连接的探针杂交并作为RNA“支架”，再生新的模板并启动额外的连接和转录循环。每个新形成的模板再次被T7 RNA聚合酶转录，产生更多的适配体，进而产生更多的支架，从而以产物辅助的方式驱动额外的连接和转录循环。这种级联反应逐渐增加了模板拷贝数和适配体产量，实现了自催化信号放大。适配体特异性地与其对应的荧光染料结合，产生与积累的转录本成比例的荧光信号。在没有目标miRNA的情况下，探针无法形成可连接的模板，从而阻止转录的启动，不会产生适配体，也不会观察到荧光增强。该平台独特地将目标识别（miRNA-探针杂交）、SplintR介导的连接、等温T7转录放大、信号转导（适配体-染料结合）和自我维持的循环放大整合在一个容器中。这种集成消除了多步骤程序、热循环、逆转录或与RPA或CRISPR等额外扩增酶/技术的耦合需求，显著降低了污染风险、复杂性和潜在的缓冲液兼容性问题。

试剂

SplintR连接酶及其相应的SplintR连接酶反应缓冲液（配方中含有50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、10 mM DTT，pH 7.5）由New England Biolabs（NEB，美国马萨诸塞州）提供，以促进高保真的RNA引导DNA连接。TO1-3PEG-Biotin荧光团（简称TO1-Biotin）是荧光检测或通过生物素-链霉亲和捕获的关键成分，由Applied Biological Materials Inc.（加拿大不列颠哥伦比亚省里士满）提供。

所提出系统的验证

如图2A所示，miRNA-21将供体探针和受体探针连接在一起，使SplintR连接酶能够将它们共价连接成全长转录模板。新形成的模板在一端含有功能性T7启动子序列，随后通过天然PAGE验证了连接（图2B），并通过T7 RNA聚合酶转录该模板以生成用于荧光读数的适配体（图2C–D）。首先进行了凝胶电泳分析以确认这一点

结论

总之，开发了一种单管、等温且无细胞的无细胞生物传感平台，用于超灵敏和特异性地检测miRNAs。该平台结合了SplintR连接酶介导的模板组装和T7 RNA聚合酶驱动的转录放大，实现了目标依赖的自我维持信号增强，无需热循环、逆转录或多酶级联。该检测方法表现出出色的分析性能，包括低

CRediT作者贡献声明

钱谢：撰写——原始草稿、研究、数据分析。林振宇：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取。陈明：数据可视化、软件处理、数据分析

未引用参考文献

de Puig等人，2021。

注释

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。我们声明与可能不当影响我们工作的其他个人或组织没有财务和个人关系，也没有任何形式的专业或其他个人利益涉及任何产品、服务和/或公司，这些可能会影响本文所述观点或对手稿的评审。

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致谢

本项目得到了国家自然科学基金（编号22574024）和福建省高校产学研合作项目（2023Y4002）的支持。