在后金属化碳纳米纤维（COFs）中实现宿主-客体限制，以增强电化学发光效应；同时结合Y形DNA扩增技术用于检测microRNA-499

《Biosensors and Bioelectronics》：Host-Guest Confinement in Post-Metallized COFs for Enhanced Electrochemiluminescence Coupled with Y-Shaped DNA Amplification for microRNA-499 Detection

本工作通过协同集成铱修饰的共价有机框架（Ir@TpBpy）与酶辅助Y型DNA扩增策略，构建了超灵敏的电化学发光（ECL）心肌梗死生物传感器，实现0.81 aM检测限，并在血清和细胞裂解液中有良好线性范围（1-1 nM），与qRT-PCR临床验证高度一致。

　　

石彬楠|茹壮壮|贾德浩|杜宇|胡丽华|刘水源|王珊|贾红英|魏秦

中国山东省济南市济南大学化学与化学工程学院界面反应与传感分析重点实验室，邮编250022

摘要

开发了一种超灵敏的电化学发光（ECL）生物传感器，用于检测急性心肌梗死（AMI）的生物标志物miRNA-499。该传感器通过将铱金属化的共价有机框架（Ir@TpBpy）与酶辅助的Y形DNA扩增技术相结合实现了这一目标。Ir@TpBpy共价有机框架是通过将富含联吡啶的TpBpy框架与Ir(III)配合物进行后金属化反应合成的。这种设计不仅通过材料负载显著提升了ECL性能，还通过协同优化策略实现了性能提升：（1）共轭框架构建了连续的电荷传输路径，加速了电子转移；（2）多孔结构产生了客体限制效应，局部富集了反应物三乙胺（TEA），促进了自由基反应动力学。同时，由Klenow片段和Nt.BbvCl酶驱动的Y形DNA扩增策略通过级联链置换反应实现了信号指数级增强。生成的输出链触发了预固定在电极表面的WO₃/CuO淬灭剂的位移，从而恢复了Ir@TpBpy的发光，实现了灵敏的“信号开启”读数。得益于这种双重扩增方法，该生物传感器在人血清和细胞裂解物中实现了0.81 aM的极低检测限（LOD），检测范围为1 aM至1 nM。使用Bland-Altman分析进行的临床验证显示，其结果与qRT-PCR结果一致，证实了这种协调调节与客体限制的协同作用为早期AMI诊断提供了一个稳健且精确的平台。

引言

微小RNA（miRNAs）是基因表达的重要调节因子。由于它们在细胞通路中起着关键作用，因此已成为疾病诊断和预后的有希望的生物标志物（Kodama等人，2020；Luby和Zheng，2017；Wang等人，2019；Zhang等人，2025）。其中，miRNA-499已被证明是急性心肌梗死（AMI）的关键指标，其在血浆中的表达水平升高与心肌细胞损伤相关（Jeyabal等人，2023；Wang等人，2011，2024）。尽管miRNA检测具有诊断潜力，但基于miRNA的诊断方法仍受到传统方法（如定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Northern印迹）的限制（Meis和Khanna，2009；Pall和Hamilton，2008；Petri等人，2019；Tota和Devaraj，2023；Zeng等人，2022）。这些方法受到劳动密集型工作流程和专业仪器需求的限制。相比之下，电化学发光（ECL）具有明显优势，即高灵敏度、良好特异性以及与便携式检测系统的良好兼容性（Zhu等人，2024b）。

ECL生物传感器因其高灵敏度、低背景噪声和易于操作而得到广泛应用，为miRNA定量提供了一种可靠的方法（Han等人，2024；Hu等人，2024；Sun等人，2024；Zhang等人，2024）。因此，已经开发了许多基于ECL的miRNA检测方法。Liao等人开发的ECL生物传感器用于检测miRNA let-7a。该设计使用掺杂环烯的二氧化钛（Pe-TiO₂）有机-无机纳米球作为高效传输体，并结合了带有锁定摆动臂和Fc轨道介导的信号释放的DNA立方体框架，实现了目标触发下的DNA行走器恢复。Pe分子在TiO₂基质中起到封闭和抑制聚集的作用，增强了界面电荷转移，从而提高了ECL的效率和结构稳定性（Liao等人，2022）。Sun等人设计了一种自增强发射体ECL生物传感器，通过羧基与三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化物的共价连接来检测miRNA-21。虽然多孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）为孔隙提供了支撑结构，但其固定的孔径（约4纳米）会限制大分子或共激活剂的扩散，从而限制了其实际应用（Sun等人，2023）。推动ECL技术发展的主要难点在于如何合理设计具有增强电子转移动力学和稳定发射特性的多孔基质（Chen等人，2022；Kuang等人，2024；Zhu等人，2025）。

共价有机框架（COFs）是一类新兴的无金属荧光剂，通过共价键构建而成（Ding和Wang，2012；Rodríguez-San-Miguel和Zamora，2019）。这些材料具有高孔隙率、结构化的通道和导电网络等有益特性，有助于离子和小分子的移动以及电荷转移（Zhu等人，2024a，2020）。COFs的可定制拓扑结构和功能通过以下关键方法提升了其ECL性能：（i）构建供体-受体对以形成稳定的自由基中间体（Li等人，2021；Luo等人，2021a）；（ii）整合发光基团和共活性单元以稳定阴离子和阳离子自由基（Meng等人，2024；Zhu等人，2021）；（iii）添加共轭键以增加π共轭，从而提高反应自由基之间的电荷转移效率（Zhang等人，2022）。将金属配合物引入COF（后金属化COF）可以增加催化剂的活性位点，改变其电子结构，并促进协同电荷转移，从而增强ECL信号（Jiang等人，2022；Li等人，2023；Zeng等人，2020）。然而，尚未研究金属化COF与级联DNA扩增的协同应用以实现超灵敏miRNA检测。

在本研究中，报道了一种创新的ECL生物传感器，用于超灵敏检测miRNA-499，该传感器结合了铱掺杂的COF（Ir@TpBpy）和Y形DNA扩增技术。金属化COF依靠微环境调节和电荷传输优化来提升ECL性能。Y形DNA纳米结构实现了酶辅助的指数级信号放大。材料和DNA的双重扩增策略解决了miRNA检测中固有的灵敏度和特异性问题。所提出的生物传感器实现了0.81 aM的超低检测限（LOD），并在人血清和细胞裂解物中表现出良好的性能。使用Bland-Altman分析方法证明，其结果与qRT-PCR结果一致，表明该方法具有较高的临床可信度。这项工作不仅以合理的方式促进了ECL生物传感器的材料工程发展，还为低丰度生物标志物的检测提供了一个多功能平台。所提出的方法在即时检测（POCT）诊断和精准医疗应用中具有巨大潜力，可以弥补实验室研究与临床实践之间的差距。

化学试剂和生物试剂

1,3,5-三甲酰氟苯酚（Tp，98%，编号1102429）、5,5'-二氨基-2,2'-联吡啶（Bpy，98%，编号1180925）和二氯四[2-(2-吡啶基)苯]二铱(III)（[(ppy)₂-Ir-μ-Cl]₂，97%，编号1046774）购自中国上海的Leyan公司。六氟磷酸银（AgPF₆，98%）购自上海Aladdin生化科技有限公司。二氯甲烷（DCM，99%）、乙酸（AcOH，98%）、四氢呋喃（THF，AR级）、1,2-二氯苯（o-DCB，99%）、N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）等试剂也用于实验。

TpBpy和Ir@TpBpy的表征

TpBpy是通过基于网状化学的典型溶热法合成的，得到了一个化学稳定的框架，其中联吡啶单元的位置精确可调，可用于金属中心的配位。通过粉末X射线衍射（PXRD）测量并结合Materials Studio进行的结构模拟，确定了Ir@TpBpy的晶体结构。

结论

在本研究中，通过将后金属化的共价有机框架（Ir@TpBpy）与Y形DNA级联扩增技术相结合，开发了一种超灵敏的ECL生物传感平台用于检测miRNA-499。机制研究表明，显著的ECL增强效果源于客体限制效应。具体而言，后金属化优化了导电框架，而多孔结构则促进了电荷传输和反应物（TEA）的富集。

CRediT作者贡献声明

贾红英：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取。王珊：验证、研究。刘水源：监督、资源提供。胡丽华：监督、资金获取。石彬楠：撰写、原始草稿编写、数据管理、概念构思。魏秦：监督、方法学设计、资金获取。杜宇：撰写、审稿与编辑、资金获取。贾德浩：撰写、审稿与编辑、方法学设计、数据管理。茹壮壮：撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22574062、22574063、22304060）、山东省自然科学基金（编号ZR2023QB019）、山东省科技中小企业创新能力提升项目（2025TSGCCZZB0987）以及济南大学和研究所创新团队项目（202534040）的支持。