《Brain, Behavior, and Immunity》：Synergistic disruption of the blood-brain barrier in tree shrews by Methamphetamine and HIV-1 Tat via TRPM2-Mediated astrocyte inflammation
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METH和HIV-1 Tat通过血脑屏障协同损伤，星形胶质细胞TRPM2通道激活介导炎症反应，抑制TRPM2可减轻损伤和神经炎症。
韩欣婷|黄建|苗琳|杨雪|徐丽莎|赵英杰|李娟|曾晓峰
中国昆明医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，国家卫生健康委员会药物成瘾医学重点实验室，昆明 650500
摘要
甲基苯丙胺（METH）滥用和HIV感染已成为全球两大公共卫生问题。METH和HIV-1 Tat蛋白（Tat）都能通过血脑屏障（BBB）进入中枢神经系统并产生神经毒性作用。然而，它们协同破坏BBB的具体机制尚不清楚。本研究利用内皮细胞与星形胶质细胞的共培养模型以及树鼩模型，探讨了瞬时受体电位M2（TRPM2）在介导METH和Tat共同引起的BBB损伤中的作用和机制。在树鼩实验中，METH和/或Tat表现出神经毒性，二者联合使用时毒性更严重，表现为紧密连接蛋白丢失、白蛋白渗漏、星形胶质细胞激活、神经炎症以及TRPM2通道激活。体外实验也显示，METH和Tat会降低紧密连接蛋白和跨内皮电阻，同时增加荧光素钠的通透性，并引发星形胶质细胞介导的炎症和TRPM2通道激活。药物抑制TRPM2可以在体外和体内减轻上述BBB损伤及星形胶质细胞相关炎症。此外，抑制TRPM2还能缓解树鼩的METH+Tat诱导的典型行为和类似焦虑的行为。关键在于，特异性敲低树鼩的TRPM2基因能有效防止METH和Tat引起的神经炎症和BBB损伤，并改善相关行为障碍。研究表明，METH和Tat可协同激活星形胶质细胞的TRPM2通道，从而引发炎症反应并最终导致BBB损伤。这些发现强调了星形胶质细胞介导的炎症在METH和Tat协同破坏BBB中的作用，TRPM2通道是一个有前景的治疗靶点，为METH和HIV-1 Tat引起的神经毒性机制提供了新的见解。
引言
甲基苯丙胺（METH），又称“冰毒”，是一种强效且高度成瘾的精神刺激剂，是全球最广泛滥用的药物之一。根据2024年世界毒品报告，2022年全球约有3000万苯丙胺类兴奋剂（ATS）使用者，其中METH占据主导地位，对全球公共卫生和社会发展造成了严重影响（2024年世界毒品报告）。值得注意的是，METH滥用已被确认为HIV感染和传播的重要风险因素（Grov等人，2020；Nerlander等人，2018；Shoptaw等人，2022）。多项研究表明，同时患有METH滥用和HIV感染的个体会出现更严重的中枢神经系统（CNS）损伤，增加患HIV相关神经认知障碍（HAND）的风险（Rogers等人，2023；Vines等人，2023）。HIV-1的转录激活因子（Tat）蛋白由HIV-1感染细胞主动分泌，是HAND发病机制的关键因素。现有证据表明，Tat具有神经毒性，可导致细胞毒性和细胞凋亡（Ajasin等人，2020）。此外，METH滥用会加剧Tat引起的神经毒性，导致更严重的神经递质代谢紊乱、氧化应激、自噬和细胞凋亡（Mediouni等人，2015）。血脑屏障（BBB）是一种高度选择性的屏障，由脑微血管内皮细胞（BECs）构成，周围环绕着基底膜、周细胞和星形胶质细胞，严格调控细胞间通透性并保护CNS免受外来物质的侵害。目前认为，BECs之间的紧密连接（TJs）是BBB的基本结构，由Occludin、Claudin及其他支架蛋白（如Zonula occludens，ZO）组成（Kaya等人，2021）。越来越多的证据表明，METH和Tat同时作用时，内皮细胞损伤和TJ蛋白异常表达会加剧（Fattakhov等人，2021；Li等人，2021；Li等人，2018b）。然而，这两种因素如何共同加剧BBB损伤尚不完全清楚。作为BBB的重要组成部分，星形胶质细胞通过接触依赖机制促进内皮细胞间TJs的形成与维持，并调节BBB中的水分和离子平衡（Daneman等人，2015；Liu等人，2020）。因此，星形胶质细胞活性的变化会显著影响BBB的正常结构和功能，导致CNS损伤。此外，星形胶质细胞是CNS中驱动神经炎症级联反应的关键细胞之一，它们通过产生促炎因子和神经毒性介质发挥作用。研究表明，长期使用METH会增加纹状体和皮层中GFAP的表达，并增加TNF-α、IL-1β和MMP-9等促炎介质的释放（Gon?alves等人，2017）。Tat是一种典型的促炎介质；直接注射Tat到小鼠海马区可导致星形胶质细胞异常激活，并增加IL-1β和MMP-9的表达（Carey等人，2024）。因此，METH和Tat均可激活星形胶质细胞，从而促进神经炎症。但目前尚无证据表明星形胶质细胞介导的炎症与METH和Tat共同作用后的BBB损伤有关，其具体机制和信号通路仍不清楚。
作为瞬时受体电位（TRP）通道超家族M亚家族的成员，TRPM2是一种非选择性阳离子通道，由同源四聚体组成，在CNS中尤其是海马区、纹状体和大脑皮层中高表达。它存在于CNS的各种细胞类型中，包括内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元（Rather等人，2023；Wu等人，2024）。TRPM2通道被认为是一种对氧化应激的细胞反应器，可导致细胞内Ca2+浓度升高，并参与多种神经系统疾病的病理进程（Huang等人，2024；Maliougina等人，2023；Zhang等人，2023）。另有研究指出，TRPM2的缺失可调节炎症应激，减少炎症细胞因子的产生和细胞凋亡相关蛋白，从而减轻海马神经元的炎症损伤及脑部疾病的病理异常（Zhu等人，2019）。Lee等人发现，在谷胱甘肽耗尽的情况下，用TRPM2抑制剂处理或转染TRPM2 siRNA的人类星形胶质细胞会减少炎症和神经毒性因子的释放，并抑制JNK、p38、ERK42/44和NF-κB等神经炎症信号通路（Lee等人，2010）。这些发现表明TRPM2通道与神经炎症密切相关，抑制TRPM2通道激活可能为炎症相关神经系统疾病提供新的治疗途径。然而，TRPM2通道和星形胶质细胞炎症在METH和Tat共同作用导致的BBB损伤中的作用及其调控机制尚未得到研究。
基于上述研究结果，本研究旨在探讨星形胶质细胞中TRPM2通道的激活是否参与了METH和Tat共同作用引起的炎症反应，以及这一过程是否进一步导致BBB损伤。树鼩在进化上比啮齿类动物更接近灵长类动物，其基因组与人类在神经系统和免疫系统方面具有高度同源性（Fan等人，2013；Fan等人，2018；Xiao等人，2017）。近年来，树鼩被广泛用作研究METH和Tat神经毒性的新型实验模型（Huang等人，2020；Li等人，2018a；Yao等人，2024）。因此，本研究选择树鼩作为体内实验对象。为研究星形胶质细胞的特定作用，使用了hCMEC/D3细胞和U-87 MG细胞构建单培养和共培养模型来模拟体外BBB环境。通过体内和体外实验以及综合实验方法，我们探讨了TRPM2通道是否调控METH和Tat共同引起的星形胶质细胞介导的炎症及随后的BBB损伤。
试剂
METH购自中国国家药品监督管理局（北京）。重组HIV-1 TAT Clade-B购自以色列Rehovot的ProSpec公司。8-Br-cADPR购自美国Montclair的Glpbio公司。荧光素钠（NaF）购自美国Saint Louis的Sigma-Aldrich公司。本研究中使用的抗体包括ZO-1（Proteintech，21773–1-AP）、Occludin（Proteintech，27260–1-AP）、Claudin 5（Cell Signaling Technology，49564）和CD31。
METH和Tat协同破坏BBB
为了评估接受METH和/或Tat处理的树鼩的BBB完整性（图1a），我们首先检测了前额叶皮层和纹状体中ZO-1和Occludin的表达水平。Western Blot结果显示，与C组相比，M组和T组中的ZO-1和Occludin表达降低。值得注意的是，M+T组中的ZO-1和Occludin水平更低（图1b-g）。上述数据表明，METH和Tat可能
讨论
体外和体内实验数据表明，METH和Tat可协同诱导BBB损伤、星形胶质细胞介导的炎症以及TRPM2离子通道激活。然而，抑制TRPM2激活可缓解这些异常。我们的研究证实，METH和Tat可通过激活星形胶质细胞的TRPM2离子通道协同引发炎症，从而导致BBB损伤（图7）。
先前的研究也
结论
实验结果表明，METH和Tat可协同诱导星形胶质细胞介导的炎症，进而损伤BBB，星形胶质细胞的TRPM2通道在此过程中起关键调控作用。这些发现为METH和Tat协同破坏BBB的机制提供了新的理论依据，并提出TRPM2作为治疗靶点，有望减轻HIV感染患者中的BBB损伤、认知障碍和神经精神症状。
伦理声明
本研究的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南，并获得了昆明医科大学伦理委员会的批准（批准编号：KMMU2020090）。
作者贡献
JH、JL和XFZ设计了研究方案，监督了所有实验工作并编辑了手稿。HXT负责文献检索、实验验证、数据分析和写作。LM、XY、LSX和YJZ负责图形的可视化处理。手稿已得到所有作者的审阅和批准。作者贡献声明
韩欣婷：撰写初稿、方法学设计、实验实施。黄建：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金争取。苗琳：撰写初稿、方法学设计、实验实施。杨雪：数据可视化、软件处理、数据管理。徐丽莎：数据可视化、软件处理、数据管理。赵英杰：数据可视化、软件处理、数据管理。李娟：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金争取。曾晓峰：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金争取资助
本研究由昆明医科大学一流学科团队（2024XKTDYS10）支持，并得到了国家自然科学基金（项目编号：82060382、82402200、82160325）、云南省基础研究重点项目（项目编号：202401AS070059）、昆明医科大学基础研究联合项目（项目编号：202501AY070001-240）以及国家卫生健康委员会药物成瘾医学重点实验室（昆明医科大学）开放项目基金的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本论文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢国家卫生健康委员会药物成瘾医学重点实验室（昆明医科大学）提供的设备和技术支持。
