《Critical Reviews in Oncology/Hematology》：CRISPR-Mediated Cancer Therapies: Approaches to Direct Tumor Targeting
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CRISPR-Cas9技术通过精准靶向致癌基因失活、肿瘤抑制基因激活及微环境改造为癌症治疗提供新思路，包括基于碱基编辑的KRAS G12D失活、同源重组修复TP53突变及CRISPR-dCas9-TET1表观调控CDKN2A。递送系统涵盖病毒载体（腺病毒、AAV、 lentivirus）和非病毒方法（脂质纳米颗粒、金纳米颗粒等），临床前研究显示CRISPR编辑T细胞在血液肿瘤中有效，但面临递送效率、肿瘤异质性和免疫毒性等挑战。
马彦娇|廖永翠
江西中医药大学，南昌，江西，330004，中国
摘要
CRISPR-Cas9技术为精准癌症治疗开辟了新的可能性，解决了化疗和放疗等传统疗法所固有的局限性。本综述探讨了基于CRISPR的直接肿瘤靶向策略，包括癌基因失活、肿瘤抑制基因重新激活以及肿瘤微环境（TME）的改变。主要进展包括：通过碱基编辑实现KRASG12D的失活，这种编辑方法使用工程化的脱氨酶引入精确的单核苷酸变化而不产生双链断裂；通过同源重组修复TP53突变，该方法利用供体DNA模板在目标位点进行修复；以及利用CRISPR-dCas9-TET1进行CDKN2A的表观遗传重塑，其中催化失活的Cas9引导TET1去甲基化酶作用于高甲基化启动子以恢复基因表达。CRISPR筛选发现了合成致死相互作用，例如在BRCA1-/-肿瘤中对PARP1的依赖性。TME编辑策略（包括改变与癌症相关的成纤维细胞）显示出增强的抗肿瘤效果。目前正通过病毒载体（如腺病毒、AAV和慢病毒）来解决递送挑战。非病毒方法包括脂质纳米颗粒、金纳米颗粒、外泌体以及响应刺激的系统（如MMP可切割和低氧响应纳米颗粒）。使用CRISPR工程改造的T细胞（例如CTX130）进行的临床试验已在血液系统恶性肿瘤中显示出缓解率。然而，仍存在重大挑战，包括细胞因子释放综合征、免疫毒性、肿瘤异质性以及实体瘤中有限的递送效率。克服这些障碍需要跨学科创新、伦理监督和技术改进，以支持基于CRISPR的策略在精准肿瘤学中的安全有效整合。
引言
癌症的负担要求治疗方法能够解决化疗和放疗等传统方法的局限性，这些方法通常与药物耐药性、全身毒性和对异质性肿瘤疗效有限有关（Balasubramanian等人，2024年）。
clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas9是一种由RNA引导的系统，能够在与特定单导向RNA（sgRNA）序列匹配的位置精确切割DNA（Diao等人，2024年）。与ZFNs或TALENs不同，CRISPR-Cas9利用Watson-Crick碱基配对将sgRNA与其DNA目标匹配，从而提高了其准确性和可扩展性。新的工具如胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器以及引导编辑器通过允许精确的单字母DNA变化或基于模板的插入而不会引起双链断裂（DSB），从而改进了这一系统，降低了意外基因组改变的风险（Balasubramanian等人，2024年；Katti等人，2022年；Yang等人，2021年）。从机制上讲，碱基编辑器将可编程的CRISPR靶向模块与核苷酸修饰酶结合，能够在定义的基因组位点直接将一个碱基转换为另一个碱基，而不会引入完整的DNA断裂。
本综述重点讨论了如何使用CRISPR直接靶向肿瘤，不涉及与免疫相关的方法。它探讨了潜在的分子机制，包括sgRNA的设计方法、高精度Cas9酶的进展、各种递送方法（如病毒载体和脂质纳米颗粒）以及治疗策略（如癌基因失活或肿瘤抑制基因重新激活）。这些创新表明，基于CRISPR的疗法有可能在不对健康组织造成损害的情况下重新编程癌症基因组。
CRISPR在癌症中的应用原理
CRISPR-Cas9系统依赖于两个主要部分：Cas9酶，它利用HNH和RuvC样结构域切割DNA；以及单导向RNA（sgRNA），这是一种将靶向序列（crRNA）与结合Cas9的结构元素（tracrRNA）结合的混合分子。sgRNA通过碱基配对引导Cas9到达基因组中的特定位置，但切割仅发生在称为PAM的短序列旁边（Chen等人，2019年）。一旦产生DSB，细胞会进行修复。
癌基因失活
CRISPR-Cas9通过靶向移码突变或基因沉默实现了精确的癌基因失活。一个显著的例子是KRASG12D的失活，这是一种在胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌中常见的功能获得性突变。使用与KRASG12D外显子2互补的sgRNA，CRISPR-Cas9通过NHEJ诱导插入/缺失，从而破坏KRASG12D的GTP酶活性和下游MAPK/ERK信号通路（Jiang等人，2020年）。在PDAC的原位模型中，这种失活效应得到了验证。
CRISPR载体的肿瘤递送
CRISPR-Cas9在癌症治疗中的有效应用依赖于能够将Cas9 mRNA、核糖核蛋白（RNP）复合物或质粒DNA递送到肿瘤细胞中的递送系统（Wang和Doudna，2023年）。这些系统必须克服细胞膜穿透、内体逃逸、免疫逃逸和脱靶效应等生物学障碍，同时保持精确的肿瘤靶向（Jaitin等人，2016年）。当前的CRISPR递送策略大致可以分为病毒和非病毒两类。
肿瘤特异性递送
旨在利用肿瘤特异性生物标志物的CRISPR递送系统的脱靶效应被最小化。逻辑门控纳米颗粒（如低氧响应聚合物）仅在低氧TME中释放CRISPR混合物（Hii等人，2024年）。例如，含有偶氮苯连接剂的聚（b-氨基酯）纳米颗粒在低氧条件下可降解，并在胰腺肿瘤中编辑KRASG12D，同时不影响正常组织（Hii等人，2024年；Rui等人，2019年）。类似地，pH敏感的脂质体也具有这种特性。临床前和临床进展
CRISPR-Cas9系统的发展加速了从临床前研究到实际癌症治疗的转化。突破性研究验证了CRISPR破坏癌细胞机制、重新编程免疫细胞和改变肿瘤微环境的能力，为人类试验奠定了基础。通过对潜在CRISPR诱导的基因毒性的研究，T细胞工程取得了显著进展。
未来方向
CRISPR驱动的癌症治疗的下一个前沿在于克服递送瓶颈、提高编辑精度以及扩大可靶向的脆弱性范围。双作用碱基编辑器结合了胞嘧啶和腺嘌呤编辑能力，现在能够多重纠正复合突变（例如NSCLC中的EGFRL858R/T790M），在对抗第三代疗法具有抗性的临床前模型中恢复酪氨酸激酶抑制剂的敏感性（Cong等人，2013年）。结论
CRISPR-Cas9通过精确靶向癌症的遗传和表观遗传驱动因素，扩展了癌症治疗的研究领域，具有通过破坏癌基因、重新激活肿瘤抑制基因和重塑微环境来克服治疗抵抗性的潜在应用。临床上，例如用于难治性血液系统癌症的 hypoimmunogenic CAR-T细胞和针对癌基因突变的碱基编辑器的发展，展示了其治疗潜力。
评论
上述进展表明，虽然基于CRISPR的癌症疗法在概念上具有变革性，但在广泛临床应用之前仍面临重大的生物学和转化障碍。肿瘤异质性是一个特别严峻的挑战，即使成功失活了KRASG12D，在胰腺癌中仍观察到不完全的反应，因为残留的克隆会激活PI3K/AKT/mTOR等补偿途径。
资金支持
本工作得到了江西省卫生健康科技计划项目（202211400）和江西省中医药管理局科技计划项目（2020B0354）的支持。
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作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。致谢
作者感谢江西省卫生健康科技计划项目（项目编号202211400）和江西省中医药管理局科技计划项目（项目编号2020B0354）的支持。马彦娇博士是中国南昌江西中医药大学的研究员。她的研究领域包括癌症生物学、基因编辑技术以及分子方法在肿瘤学研究中的应用。
