《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Earthworm responses to veterinary antibiotics: Physiological impairment, gut microbial dysbiosis, and enrichment of antibiotic resistance genes
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兽医抗生素（VAs）的滥用严重威胁土壤生态与公共健康，但其对关键土壤生物（如蚯蚓）的系统毒性机制尚不明确。本研究以泰乐菌素（TYL）、恩诺沙星（ENR）和金霉素（CTC）为对象，探讨了其在个体生长、氧化应激、肠道健康、微生物组及抗性基因（ARGs）水平对蚯蚓的多维毒性效应，揭示了VAs通过诱导氧化损伤、破坏肠道屏障与菌群稳态、富集ARGs并增强其水平转移风险的综合毒理机制，为评估VAs的土壤生态风险提供了科学依据。
在现代化集约养殖中，抗生素被大量用于保障动物健康、控制疾病和促进生长。然而，全球范围内兽用抗生素（Veterinary Antibiotics, VAs）的使用量惊人，预计到2030年将超过10万吨。这些药物在动物体内生物利用度有限，有30%至90%会以原形或活性代谢物形式通过排泄物进入环境，在土壤中形成持久性的生物活性污染物“蓄水池”。泰乐菌素（Tylosin, TYL）、恩诺沙星（Enrofloxacin, ENR）和金霉素（Chlortetracycline, CTC）作为大环内酯类、氟喹诺酮类和四环素类的代表性药物，因其广谱抗菌活性而被广泛使用，具有高环境持久性和显著的生态风险熵值，成为土壤生态系统的关键风险因子。调查显示，在施用粪肥的农田等“热点”区域，这些抗生素的残留浓度可达惊人水平。更为严峻的是，抗生素的长期残留不仅会抑制土壤动物种群，严重扰动土壤微生物生态，还会导致抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）的富集和传播，对生态安全和公共卫生构成重大威胁。蚯蚓作为土壤中的“生态系统工程师”，通过吞食土壤、挖掘洞穴等行为深刻影响着土壤结构和功能健康，其每日吞食土壤量可达自身体重的30%。这种持续的摄食和活动也使蚯蚓成为污染物暴露的主要靶标和传播的关键载体。然而，关于典型兽医抗生素对这类关键物种的多尺度毒性效应，目前仍缺乏系统认知。为填补这一知识空白，评估VAs对土壤生态系统的综合风险，一项针对VAs多维毒性效应的研究在《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》期刊上发表。
研究人员以标准毒性测试物种赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）为研究对象，将其暴露于含有环境相关浓度（20 mg/kg）的TYL、ENR和CTC的污染土壤中，进行了为期28天的亚慢性毒性实验。研究采用了多组学与多维度相结合的分析策略，关键技术与方法包括：1）表型与生理生化指标分析：定期监测蚯蚓体重、茧和幼体数量以评估生长繁殖；测定活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）等抗氧化酶活性以评估氧化应激水平；测定淀粉酶（AMS）、蛋白酶、纤维素酶（CL）、脂肪酶（LPS）等消化酶活性以评估肠道功能。2）分子生物学分析：通过实时定量PCR（qPCR）技术检测与生长发育（ann, tctp, sox2）、氧化应激（hsp70, crt, cyp）和肠道屏障功能（occludin, zo-1）相关的功能基因表达水平。3）组织病理学分析：对蚯蚓表皮和肠道组织进行石蜡切片及苏木精-伊红（H&E）染色，在显微镜下观察组织结构损伤。4）肠道微生物组分析：对蚯蚓肠道内容物进行16S rRNA基因V3-V4区高通量测序，分析微生物群落结构、多样性、组成变化，并构建分子生态网络分析其互作与稳定性。5）抗性基因定量分析：利用qPCR技术定量检测蚯蚓肠道及周边土壤中与三种抗生素对应的抗性基因（ermF, qnrS, tetA, tetG, tetX）及水平转移标志基因I类整合子整合酶基因（intI1）的绝对丰度。
3.1. VAs诱导的蚯蚓生长与繁殖抑制
暴露于三种VAs导致蚯蚓体重持续下降，到实验结束时平均体重减少23.3%–33.7%，其中ENR抑制作用最强。同时，VAs降低了茧产量（2.96%–36.8%）和幼体数量（23.1%–37.2%），并使茧和幼体出现萎缩、形态不规则等异常。分子层面，与生长发育相关的ann和tctp基因表达下调，而与胚胎发育和干细胞维持相关的sox2基因表达显著上调，这可能是一种应激反应或补偿机制。这些结果表明VAs在表型和分子水平上均抑制了蚯蚓的生长与繁殖。
3.2. VAs诱导的蚯蚓氧化应激
三种VAs均诱导蚯蚓体内ROS过量产生和MDA积累，表明引发了氧化应激和脂质过氧化损伤，其强度顺序为ENR > CTC > TYL。作为防御，SOD、CAT活性在暴露期被激活，但POD活性在28天时受到抑制，GST活性在整个暴露期均被抑制，表明抗氧化防御系统在长期高强度胁迫下出现功能失调。相关基因表达分析显示，hsp70和crt基因表达持续下调，反映细胞修复机制代偿失败；而cyp基因（编码细胞色素P450）表达上调，表明I相解毒途径被激活，但与II相解毒酶GST的活性抑制形成脱节，可能导致有毒中间体积累，加剧氧化应激的恶性循环。
3.3. VAs诱导的蚯蚓肠道健康损伤
3.3.1. 肠道和表皮的组织病理学改变
组织切片显示，对照组蚯蚓表皮和肠道结构完整。而暴露组出现梯度性结构损伤。表皮可见破裂或增生，纵肌间隙增大甚至撕裂，ENR组还观察到环肌坏死。肠道方面，TYL和CTC组主要表现为黄体组织充血肿胀（代偿性应激），CTC组绒毛结构受损。ENR组损伤最严重，表现为肠上皮变薄、空泡化，黄体组织和肠上皮萎缩脱落，绒毛结构广泛破坏。这种损伤梯度与生长抑制和氧化应激强度完全一致，表明肠道是抗生素系统毒性的主要靶器官。
3.3.2. 消化功能紊乱与关键基因表达异常
暴露初期（14天），AMS和蛋白酶活性被激活，可能是机体增强营养水解的代偿机制。随着胁迫加剧，到28天时AMS活性降至对照组以下，蛋白酶活性与对照组无显著差异，而CL和LPS活性在整个暴露期均受到抑制。这严重损害了蚯蚓对营养物质的利用，导致能量供应不足。同时，维持肠道紧密连接屏障的关键基因occludin和zo-1的表达在暴露后期被显著抑制，这破坏了肠道上皮紧密连接的分子基础，损害了肠道屏障功能。
3.4. VAs诱导的蚯蚓肠道菌群失调
3.4.1. 群落多样性与丰富度的改变
α-多样性分析显示，VAs暴露（尤其是ENR）增加了蚯蚓肠道菌群的物种丰富度（Chao1, Sobs指数）和多样性（Shannon指数）。然而，这种“伪多样性”的增加可能反映了抗生素胁迫导致的菌群稳态崩溃，为机会菌和病原菌入侵创造了生态位。PLS-DA（偏最小二乘判别分析）表明不同VAs处理显著改变了肠道菌群结构，且效应具有化合物特异性。
3.4.2. 群落结构转变与潜在健康风险
在门水平，放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Proteobacteria）是优势菌门。CTC处理增加了放线菌门的相对丰度，TYL处理增加了包含多种机会病原菌的变形菌门丰度，而绿弯菌门在TYL和CTC处理中丰度下降。在属水平，潜在益生菌属如假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）和链霉菌属（Streptomyces）丰度下降，而一些潜在致病菌属如诺卡氏菌属（Nocardioides）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）和不动杆菌属（Acinetobacter）在特定处理中显著富集，提示健康风险。?2.5, p?
3.4.3. 微生物网络稳定性与复杂性降低
分子生态网络分析显示，ENR和CTC处理降低了网络的平均连接度和平均聚类系数，增加了平均路径长度，表明微生物间互作减弱，群落结构稳定性下降，生态系统恢复力降低。虽然关键细菌类群（模块中心）数量增加，但其中包含放线菌门和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）等被认为是ARGs潜在宿主的类群，其高连接性可能间接促进了抗性组的存续和增殖。
3.5. VAs诱导的ARGs富集
三种VAs对蚯蚓肠道及周边土壤中的ARGs表现出化合物特异性的选择富集效应。TYL暴露上调了大环内酯类抗性基因ermF；ENR暴露使喹诺酮类抗性基因qnrS丰度达到最高；CTC暴露特异性激活了蚯蚓肠道中的四环素类抗性基因tetA和tetX以及土壤中的tetG。尤其值得关注的是，三种VAs处理，特别是ENR和CTC，均显著增加了标志水平基因转移（HGT）潜力的I类整合子整合酶基因intI1在蚯蚓肠道和土壤中的丰度。这表明抗生素暴露不仅富集了特定ARGs，还增强了其在不同微生物间水平转移的风险。
结论与讨论
本研究系统阐明了TYL、ENR和CTC三种典型兽医抗生素对蚯蚓从个体到分子、从宿主到共生微生物的多维毒性效应。研究结论可归纳为：1）VAs在个体水平显著抑制蚯蚓生长与繁殖，并伴随相关功能基因（ann, tctp）表达失调。2）VAs诱导蚯蚓产生强烈氧化应激，导致ROS和MDA积累，并引起抗氧化防御系统（如POD、GST）功能失调及相关应激基因（hsp70, crt）表达抑制。3）氧化损伤与基因表达下调共同导致蚯蚓表皮和肠道严重的组织病理学损伤（尤其以ENR最为严重），进而引起消化酶活性异常和肠道屏障关键基因（occludin, zo-1）表达下调，损害营养代谢与屏障功能。4）VAs破坏了蚯蚓肠道菌群稳态，导致微生物多样性异常升高、群落结构改变、潜在致病菌富集以及微生物互作网络稳定性下降，引发肠道微生态失调。5）VAs暴露在蚯蚓肠道及周边土壤中特异性富集了相应的ARGs，并显著增加了水平转移标志基因intI1的丰度，极大增强了ARGs在环境中传播扩散的风险。
这项研究的重要意义在于，它首次从“生理损伤-肠道菌群失调-抗性基因增殖”的联动视角，全面揭示了兽医抗生素对土壤关键物种蚯蚓的多维毒理机制。研究不仅证实了VAs对非靶标土壤生物的显著毒性，更重要的是揭示了蚯蚓作为“生态系统工程师”，可能在抗生素胁迫下，其受损的肠道微环境成为ARGs富集和水平转移的“热点”，从而在生物介导下放大ARGs在土壤生态系统中的传播风险。这为理解抗生素污染对土壤健康的综合威胁提供了新的证据和视角。研究成果强调了在“同一健康”（One Health）框架下，管控兽用抗生素使用、评估其生态环境风险、以及制定针对性污染控制策略的紧迫性和重要性，为相关的风险管理与政策制定提供了关键的科学依据和数据支撑。
