原籍益生菌Lacticaseibacillus rhamnosus NCDC 610的体外和体内毒理学安全性评估

《Food and Chemical Toxicology》：In vitro and in vivo toxicological safety assessment of indigenous probiotic Lacticaseibacillus rhamnosus NCDC 610

乳酸乳球菌NCDC 610从发酵乳制品Rabdi中分离，经体外及体内毒理学评估证实无致病性、溶血性、产胺类及细胞毒性，对HT-29细胞存活率>95%，动物实验未发现毒性反应或器官损伤，支持其作为益生菌开发。

　　

安吉拉·约瑟夫（Angela Joseph）| S.V. 萨利尼（S.V. Salini）| 巴图拉·纳西姆卢（Battula Narsimlu）| 萨钦·库马尔（Sachin Kumar）| 马诺拉玛·库马里（Manorama Kumari）| 普拉迪普·V·贝哈雷（Pradip V. Behare）

技术功能启动实验室（Techno-functional Starter Lab），国家乳品菌种收藏中心（National Collection of Dairy Cultures, NCDC），乳品微生物学部门（Dairy Microbiology Division），印度哈里亚纳邦卡纳尔（Karnal）的ICAR-NDRI研究所，邮编132001

摘要

Lacticaseibacillus rhamnosus NCDC 610是从谷物发酵乳制品“Rabdi”中分离出来的，此前已显示出抗菌、免疫调节、降胆固醇和抗糖尿病的特性。为了确保其在食品和益生菌制剂中的安全应用，我们根据ICMR和OECD的指南进行了全面的临床前安全性评估。我们进行了一系列体外和体内实验，以评估其毒力因子、黏蛋白降解能力、生物胺的产生、对抗生素的敏感性以及在HT-29细胞中的细胞毒性以及黏附能力。此外，还在C57BL/6小鼠中进行了急性和亚急性口服毒性研究，包括血液学、生物化学、组织病理学和免疫学参数的检测。Lcb. rhamnosus NCDC 610缺乏与毒力相关的属性，也未表现出溶血、明胶酶、凝血酶、DN酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖醛酸酶活性。通过比色法和HPLC分析证实，该菌株既不利用黏蛋白也不产生生物胺。此外，Lcb. rhamnosus NCDC 610对临床相关的抗生素敏感，在HT-29细胞中保持了超过95%的细胞活力，并表现出对肠上皮细胞的适度黏附性。体内研究未发现与治疗相关的毒性、行为异常、器官损伤或不良免疫反应。综上所述，这些发现证明了Lcb. rhamnosus NCDC 610的体外和体内安全性，支持其作为功能性益生菌候选物的进一步评估。

引言

近年来，人们对有益微生物在促进人类健康方面作用的认可度不断提高，从而推动了对抗生素的兴趣。益生菌被定义为“当以适当剂量摄入时，能够为宿主带来健康益处的活微生物”（Hill等人，2014年）。这些微生物主要通过调节肠道微生物群来发挥其有益作用，肠道微生物群是胃肠道内一个复杂而动态的微生物生态系统，在宿主的新陈代谢、免疫调节和屏障功能中起着关键作用（Zhou等人，2024年）。益生菌与多种健康益处相关，包括缓解胃肠道疾病、免疫调节、心血管支持、降低肥胖相关风险以及抗氧化、抗癌和神经保护作用（Hojjati等人，2020年；Joshi等人，2024年；美国国立卫生研究院膳食补充剂办公室，2025年）。目前广泛使用的益生菌包括属于乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）属的乳酸菌（Falah等人，2019年），以及某些酵母菌如Saccharomyces boulardii（Fijan，2014年）。即使在同一属或物种内，不同益生菌菌株对宿主的有益作用也存在很大差异。因此，必须单独评估每种益生菌菌株（Barzegar等人，2023年）。

尽管益生菌具有健康益处，但它们与传统食品成分和药品不同，因为它们是以能够暂时定植的活微生物形式摄入的。这一特性引发了安全性问题，包括潜在的全身感染、代谢紊乱、过敏反应或在易感个体中水平转移抗生素抗性决定因素的风险，这突显了进行全面安全性评估的必要性，特别是对于用于治疗目的或脆弱人群的菌株（Liu等人，2024年；Merenstein等人，2023年）。

因此，在临床或商业使用之前，对特定菌株进行严格的安全性评估是必不可少的。FAO/WHO（2002年）的国际指南概述了益生菌安全性和有效性评估的一般原则，而印度医学研究委员会-生物技术部（ICMR-DBT）也提供了评估益生菌菌株的国家建议（Ganguly等人，2011年）。然而，专门针对益生菌安全性测试的标准化协议仍然有限，体内毒性评估通常采用OECD的啮齿动物毒性指南来生成支持性数据（OECD，2008年）。

在乳酸菌中，Lacticaseibacillus rhamnosus NCDC 610（前称为RSI-3）是从谷物发酵乳制品“Rabdi”中分离出来的（Basu，2011年），已显示出多种益生菌特性，包括耐酸性和耐胆汁性、胆盐去结合能力、细胞表面疏水性以及抗菌和抗真菌活性（Minj，2011年）。后续研究报道了其抗菌、免疫调节和降胆固醇效果（Kadam，2013年）、抗糖尿病潜力（Minj，2011年），以及在肥胖诱导的动物模型中对男性生殖健康的有益作用（Akram等人，2022年）。比较评估表明，NCDC 610的表现与公认的参考菌株Lcb. rhamnosus GG相当或更优。该菌株还成功用于与本地嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株结合开发谷物基功能性发酵乳制品（Basu，2011年）。

鉴于Lcb. rhamnosus NCDC 610的有希望的功能特性，在将其应用于人类健康干预之前，进行全面的安全性评估是必要的。目前的ICMR建议强调从体外特征分析开始，然后进行体内研究以评估安全性和耐受性。因此，本研究采用体外实验和小鼠模型系统地对Lcb. rhamnosus NCDC 610进行了毒理学和安全性评估，以确定其是否适合用于未来的益生菌和功能性食品应用。

细菌培养

益生菌菌株Lcb. rhamnosus NCDC 610来自印度哈里亚纳邦卡纳尔的ICAR-国家乳品研究所（NDRI）的国家乳品菌种收藏中心（NCDC）。该菌株在无菌的de Man、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基（HiMedia，印度）中于37°C下孵育12-18小时活化。指示菌株大肠杆菌 NCDC 134、金黄色葡萄球菌 NCDC 110和蜡样芽孢杆菌 NCDC 66也从ICAR-NDRI获取。此外，还获取了金黄色葡萄球菌 ATCC

DN酶活性

Lcb. rhamnosus NCDC 610不具有DN酶活性（图1A），这一点从无透明圈的结果可以看出，而阳性对照金黄色葡萄球菌 ATCC 29213则在孔周围显示出粉红色的透明圈。这与之前的研究结果一致（Nandi和Mandal，2025年；Rahmati-Joneidabad等人，2024年；Zibaei-Rad等人，2023年），其中益生菌乳酸菌株未显示DN酶活性。

溶血活性

根据EFSA的安全指南，NCDC 610表现出γ-溶血行为

结论

对于拟用于人类消费的益生菌菌株而言，证明其安全性是首要要求，尤其是在缺乏先前安全使用记录的情况下。我们的研究表明，Lcb. rhamnosus NCDC 610缺乏致病性特征、毒力决定因素和临床相关的抗生素抗性，且不表现出细胞毒性。其对肠上皮细胞的适度黏附性表明其与宿主的相互作用是安全的，支持其作为益生菌候选物的适用性。

CRediT作者贡献声明

安吉拉·约瑟夫（Angela Joseph）：撰写——原始草稿，研究。 S.V. 萨利尼（S.V. Salini）：撰写——审阅与编辑，方法学，数据分析。 巴图拉·纳西姆卢（Battula Narsimlu）：撰写——审阅与编辑，方法学，数据分析。 萨钦·库马尔（Sachin Kumar）：撰写——审阅与编辑，方法学。 马诺拉玛·库马里（Manorama Kumari）：撰写——审阅与编辑，方法学。 普拉迪普·V·贝哈雷（Pradip V. Behare）：撰写——审阅与编辑，监督，资源管理，方法学，概念构建。

资助

本研究由印度哈里亚纳邦卡纳尔的ICAR-国家乳品研究所（ICAR-NDRI）资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢印度哈里亚纳邦卡纳尔的ICAR-国家乳品研究所（ICAR-National Dairy Research Institute）和印度希萨尔（Hissar）的国家兽医型菌种收藏中心（NCVTC）提供的必要研究设施和财务支持。