通过细胞生物学实验、网络毒理学和分子对接技术，探索PFDoA诱导小胶质细胞焦亡的潜在机制

《Food Bioscience》：Exploring the potential mechanisms of PFDoA-induced microglial pyroptosis using cell biology experiments, network toxicology and molecular docking

PFDoA诱导微胶质细胞pyroptosis并激活PPARγ/ROS/TXNIP通路，通过形态学观察（TEM）、LDH释放及IL-1β/IL-18分泌证实细胞毒性，生物信息学预测PFDoA与PPARγ存在相互作用，揭示其神经毒性机制。

　　

Kai-Yi Zhong|Yong Zhang|Nai-Dong Wang|Guang-Wen Li|Xian-Jun Zhang|Zhi-Jun Yang

青岛大学附属医院神经内科，中国青岛，266000

摘要

全氟十二烷酸（PFDoA）是一种含有12个碳原子的全氟羧酸，广泛存在于食品包装材料、海鲜、地表水和土壤中，对食品安全和人类健康构成潜在风险。PFDoA倾向于在脑部积累，可能导致认知障碍，但其潜在机制尚不清楚。在本研究中，我们通过体外实验和生物信息学分析相结合的方法，探讨了PFDoA对小胶质细胞的细胞毒性作用及其机制。人类小胶质细胞克隆3（HMC3）细胞系在50、100和200 μmol/L的PFDoA浓度下处理24小时。通过透射电子显微镜、流式细胞术和免疫荧光技术检测焦亡现象，以及活性氧（ROS）的产生、乳酸脱氢酶（LDH）的释放和炎症细胞因子（IL-1β和IL-18）的分泌。生物信息学分析和分子对接技术用于预测PFDoA与过氧化物酶体增殖活化受体（PPARs）之间的相互作用。结果表明，PFDoA暴露诱导了小胶质细胞的焦亡，这一现象通过透射电子显微镜和流式细胞术观察到的形态变化得到证实。处理后ROS水平升高，LDH、IL-1β和IL-18的释放显著增加。生物信息学和分子对接分析表明PFDoA可能与PPARγ存在相互作用。从机制上看，PFDoA诱导的小胶质细胞焦亡可能与PPARγ/ROS/TXNIP通路的变化有关。本研究为PFDoA引起的神经毒性提供了新的机制见解，并强调了饮食和环境暴露于PFDoA的潜在健康风险。

引言

全氟十二烷酸（PFDoA）是一种含有12个碳原子的全氟羧酸（PFCA），广泛应用于商业和工业领域，如食品包装、纺织品制造和阻燃材料（L. Ding等人，2009年）。由于其广泛使用、强化学稳定性和抗降解性，PFDoA已成为一种持久性的环境污染物，在野生动物和水生环境中广泛分布，如地表水、沉积物和土壤（Goodrow等人，2020年；T. Wang等人，2011年）。值得注意的是，PFDoA也在室内环境中被检测到，有研究报道在车辆、办公室和住宅区收集的灰尘中发现了其存在（Fraser等人，2013年）。

对食品安全特别令人担忧的是，PFDoA是美国海鲜样本中最常检测到的全氟化合物之一，包括螃蟹、蛤蜊和虾（Young等人，2022年）。此外，PFDoA还存在于各种动物源性食品中，如肝脏、鸡蛋、奶酪和牛奶（Koenig等人，2025年）。这些结果表明，饮食摄入是人类接触PFDoA的重要途径。其在大体内的生物积累已在人类血清中得到证实（Gao等人，2025年；Han等人，2018年；J. Li等人，2024年；Luo等人，2021年）。PFDoA表现出显著的毒性效应，包括生殖和发育毒性（Kato等人，2015年）。最近的研究表明，与其他全氟化合物相比，PFDoA更倾向于在脑部积累，可能导致认知障碍。例如，一项加拿大出生队列研究显示，PFDoA暴露与较低的认知综合得分相关（β = ?2.0，95% CI: ?3.9至?0.01）（Reardon等人，2023年）。此外，一项动物研究发现，单次口服50 mg/kg PFDoA会导致Wistar大鼠的认知能力下降。九天后，脑组织中的PFDoA浓度约为44.0 μg/g，而血清浓度为24.4 μg/mL。这些结果表明PFDoA能够穿过血脑屏障并在脑部容易积累（Kawabata等人，2017年）。

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞（Prinz等人，2019年）。小胶质细胞介导的炎症反应与神经退行性疾病密切相关（Prinz & Priller，2014年；L. Xu等人，2016年）。焦亡是一种炎症细胞死亡类型，通常由炎性小体引发。NLR家族pyrin结构域含有3（NLRP3）炎性小体激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（caspase-1），后者切割gasdermin D（GSDMD）。GSDMD的N端片段转移到细胞膜上，形成孔洞释放炎症因子如白细胞介素（IL）-1β和IL-18。这一过程导致细胞膜肿胀和破裂，最终引发焦亡（Wu, Wang等人，2024年）。焦亡与神经炎症反应和认知障碍有关（Hao & Feng，2023年；Rui等人，2021年）。我们之前的研究表明，甜菜碱可以通过抑制NLRP3介导的小胶质细胞焦亡来缓解同型半胱氨酸引起的认知障碍（Z. J. Yang等人，2024年）。尽管越来越多的证据表明PFDoA暴露与氧化应激和认知障碍有关，但PFDoA是否诱导小胶质细胞焦亡尚未得到研究。

氧化应激由活性氧（ROS）驱动，是焦亡的关键调节因素（J. Wang等人，2024年；Z.-J. Yang, Huang等人，2025年；Zhong等人，2025年）。ROS触发硫氧还蛋白（TXNIP），TXNIP可以直接激活NLRP3炎性小体，导致细胞焦亡（Nasoohi等人，2018年）。一些研究表明PFDoA可以诱导氧化应激。例如，50和100 μmol/L浓度的PFDoA在PC12细胞中引起了氧化应激（Fang等人，2020年）。此外，急性PFDoA暴露通过引发氧化应激和破坏抗氧化系统的稳态导致斑马鱼肝脏损伤（Y. Liu等人，2008年）。同样，5和10 mg/kg/天的PFDoA暴露导致SD大鼠出现显著的肝毒性，表现为过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性降低以及脂质过氧化水平升高（H. Zhang等人，2008年）。然而，ROS介导的炎性小体激活和小胶质细胞焦亡在PFDoA暴露中的具体作用仍不清楚。

过氧化物酶体增殖活化受体（PPARs）是配体激活的转录因子，在调节中枢神经系统内的神经炎症和氧化应激中起关键作用（Aleshin & Reiser，2013年；Bright等人，2008年）。PPARs的三种异构体是PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。PPARα表达在星形胶质细胞、海马体和小脑中（Titus等人，2024年）。PPARβ/δ广泛分布于大脑各区域，尤其是在少突胶质细胞和神经元中（Hall等人，2008年；Titus等人，2024年）。PPARγ表达在小胶质细胞、星形胶质细胞、海马体和小脑中（Bright等人，2008年；Titus等人，2024年）。激活PPARγ已被证明可以改善由反复轻度脑损伤引起的认知障碍（Pearson等人，2024年）。此外，PPARγ还被报道可以调节炎症（Mrak & Landreth，2004年）和减轻氧化应激（Lan等人，2023年；Polvani等人，2012年）。此外，激活PPARγ可以抑制细胞内ROS的产生并抑制TXNIP的表达，从而防止TXNIP介导的NLRP3炎性小体激活（Z. Li等人，2022年）。目前尚未研究PFDoA是否通过PPARγ/ROS/TXNIP信号通路诱导小胶质细胞焦亡。

尽管PFDoA与认知障碍有关，但其神经毒性的潜在机制，特别是其对小胶质细胞的影响仍不甚清楚。本研究旨在阐明PFDoA导致小胶质细胞焦亡的机制。首先，使用透射电子显微镜和免疫荧光技术检测焦亡。然后，通过荧光探针检测氧化应激。接着，利用生物信息学方法预测相关通路。最后，通过Western blotting研究潜在机制。本研究为PFDoA的神经毒性效应提供了新的见解，并有助于更好地理解饮食和环境暴露于PFDoA的潜在健康风险。

材料

PFDoA（CAS编号：307-55-1，纯度：≥95%）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。一抗（ASC、GSDMD、GSDMD-N、PPARγ、IL-1β、IL-18、NLRP3、TXNIP、pro-caspase-1和β-actin）购自Abcam Plc（英国剑桥）。切割型caspase-1一抗购自Cell Signaling Technology（美国波士顿）。

细胞培养

人类小胶质细胞克隆3（HMC3）细胞系购自Procell生命科学技术有限公司（中国武汉）。

PFDoA诱导的小胶质细胞焦亡

通过CCK-8方法评估PFDoA对细胞活力的影响。如图1A所示，50、100和200 μmol/L浓度的PFDoA处理24小时后，HMC3细胞的活力显著下降，表明PFDoA具有细胞毒性。在初步实验中，10和25 μM浓度的PFDoA处理未观察到细胞活力显著下降。TEM结果显示，PFDoA处理诱导了焦亡的关键特征。

讨论

PFDoA广泛存在于食品包装、海鲜和地表水中，是饮食和环境暴露的重要来源。尽管PFDoA已被证明会导致认知障碍，但其机制仍需进一步研究。本研究表明，PFDoA诱导的小胶质细胞焦亡可能与PPARγ/ROS/TXNIP信号通路的调节有关（图5），为这种新兴食品相关污染物的神经毒性效应提供了新的机制见解。

小胶质细胞

结论

总之，本研究利用细胞生物学方法和网络毒理学阐明了PFDoA诱导的小胶质细胞焦亡的机制。结果显示，PFDoA诱导了小胶质细胞焦亡和氧化应激。生物信息学分析强调了PPAR通路在PFDoA引起的认知障碍中的潜在作用。分子对接结果表明，PFDoA可能与PPARγ相互作用。此外，PFDoA处理还增强了...

作者贡献声明

Kai-Yi Zhong：撰写——原始草案、项目管理、方法学、研究设计、资金获取、数据管理、概念构思。Yong Zhang：方法学、数据管理。Nai-Dong Wang：方法学、数据管理。Guang-Wen Li：方法学、数据管理。Xian-Jun Zhang：方法学、数据管理。Zhi-Jun Yang：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草案、可视化、监督、方法学、研究设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了中国山东省自然科学基金（编号：ZR2024QH427）的支持。