关于金合欢树胶（塞内加尔和塞亚尔产）的钙结合机制：溶剂化在结合过程中的重要性

《Food Hydrocolloids》：On the calcium binding mechanisms of acacia gums ( Senegal and seyal): importance of solvation in the binding process

通过电位滴定、等温滴定量热法和QCM-D研究两种阿胶树胶与Ca2+的相互作用，发现其结合容量与pH相关，最大值分别为12.7和13.4 mg/g，结合受熵驱动，并伴随质子释放。

　　

郝莉 | 迈克尔·尼根 | 克里斯蒂安·桑切斯 | 丹尼斯·雷纳尔

UR 1268 生物聚合物相互作用与组装，INRAE，法国南特44316

摘要

金合欢胶显著的Ca²⁺结合能力在食品应用中既带来了有利的一面，也带来了不利的一面，这突显了理解其结合机制的必要性。我们使用双电极电位滴定、等温滴定量热法（ITC）和带耗散的石英晶体微天平（QCM-D）定量表征了Ca²⁺与脱矿后的A. senegal和A. seyal胶之间的相互作用。电位滴定结果显示，Ca²⁺的结合能力具有明显的pH依赖性，在pH 7.0时，A. senegal胶的最大结合能力为12.7 mg g^?1，A. seyal胶的最大结合能力为13.4 mg g^?1，相当于每个羧基结合一个Ca²⁺离子；而这种结合能力随着pH值的降低而逐渐减弱。在pH 5.0时，Ca²⁺的结合引发了明显的质子释放，这是由于结合导致葡萄糖醛酸（GlcA）的pK_obs降低所致。ITC显示，Ca²⁺的结合亲和力适中（K_a在10³-10⁴ M^?1范围内），并且结合过程表现为正的表观焓变（ΔH_obs），这可能表明熵驱动的脱水作用掩盖了本来的放热复合过程。

引言

金合欢胶，俗称阿拉伯胶，是从金合欢树的茎和枝条中提取的一种可食用干燥分泌物。本质上，它是一种天然存在的异质复合体，由阿拉伯半乳聚糖（AGPs）和蛋白质组成，其中蛋白质或肽通过羟脯氨酸和丝氨酸残基与多糖块共价连接。这类物质在植物中广泛存在（Akiyama等人，1984年）。

金合欢胶可能是最受欢迎的水溶性胶体（E414），具有悠久的应用历史，其功能已在众多工业领域得到验证（Sanchez等人，2018年）。商业金合欢胶主要来源于A. senegal和A. seyal，富含带电单糖，如葡萄糖醛酸（GlcA）和/或4-O-甲基葡萄糖醛酸（4-O-Me-GlcA）（表1）。这些胶中的AGP大分子通常以钙（Ca）、镁（Mg）和钾（K）盐的形式存在。最新数据显示，A. senegal胶中的矿物质含量（按重量百分比排序）分别为0.62%、0.78%和0.17%，A. seyal胶中的含量分别为0.91%、0.25%和0.11%（Antoine-Michard，2022年）。这些内源性阳离子在分泌物形成中的作用尚不清楚。文献表明，GlcA和/或4-O-Me-GlcA在体外与Ca²⁺离子的相互作用具有pH依赖性，支持了葡萄糖醛酸化AGPs参与植物生长相关Ca²⁺波动的假设（Lamport & Várnai，2013年）。Ca²⁺离子至少具有两种生物学功能：一种是结构功能，例如细胞壁中以毫摩尔浓度存在的Ca²⁺与果胶的结合；另一种是信号传导功能，即游离Ca²⁺浓度的纳米摩尔变化在细胞质和细胞器中传递信号（Lopez-Hernandez等人，2020a，Lopez-Hernandez等人，2020b）。值得注意的是，金合欢胶中的AGPs常被用作体外研究的模型系统，以阐明其生物学功能（Cartmell等人，2018年；Lamport & Várnai，2013年；Lopez-Hernandez等人，2020a）。

A. senegal胶的分子组成已经通过疏水相互作用色谱（HIC）被详细研究，并根据疏水性平衡分为三个组分：（1）阿拉伯半乳聚糖-肽（AG-peptide，HIC-F1），占胶的85-90%，蛋白质含量极低（约1%）；（2）阿拉伯半乳聚糖-蛋白质组分（AGP，HIC-F2），占胶的10-12%，蛋白质含量为8-12%；（3）糖蛋白组分（GP，HIC-F3），占胶的1-2%，蛋白质含量最高可达25%。HIC-F1到HIC-F3的疏水性逐渐增加，这与它们的蛋白质含量一致（Mejia Tamayo等人，2018年）。与A. senegal胶相比，A. seyal胶的工业性能（如乳化性能）通常较差，但在某些工业应用中仍可作为A. senegal胶的替代品（Sanchez等人，2018年）。

先前的多项研究试图阐明Ca²⁺与不同金合欢胶及其他植物来源的AGPs之间的相互作用（Debon & Tester，2001年；Kolb & Kunkel，1994年；Lamport & Várnai，2013年）。例如，Debon和Tester（2001年）发现Ca²⁺与金合欢胶的相互作用在酸性条件下不会发生，在中性条件下主要是静电作用。然而，大多数研究由于对测试胶的生化和结构参数了解不足，导致难以进行定量分析。此外，关于AGP-Ca²⁺相互作用的热力学参数知之甚少。Pfeifer等人（2020年）使用等温滴定量热法研究了Zostera marina中的葡萄糖醛酸化AGPs与Ca²⁺之间的相互作用，发现结合过程同时受焓变（即放热）和熵变驱动，结合常数K_a在pH 6、20 mM MES缓冲液中的值为1.6 × 10⁴ M^?1。相比之下，ITC未检测到A. sativa果实中的AGPs与Ca²⁺的结合。这些研究表明，AGPs的Ca²⁺结合能力具有物种依赖性，反映了大分子结构和组成的差异。Fang等人（2007年）研究了pH 4.5、20 mM醋酸缓冲液中A. senegal胶与Ca²⁺之间的相互作用，发现结合过程是放热的，主要由熵变驱动，结合常数K_a为3.4 × 10³ M^?1。尽管主要由熵变驱动的特性与我们的结果一致，但在pH 5.0时的放热行为与我们的观察结果不符。pH值、离子强度、缓冲液离子的电离焓以及金合欢胶的生物来源等因素都会显著影响Ca²⁺结合的热力学参数。因此，深入讨论热力学参数对于理解金合欢胶等食品水溶性胶体的阳离子结合机制至关重要。此外，以往的研究大多忽略了Ca²⁺结合过程中的质子释放现象。在本研究中，我们实时监测了这一过程，并发现其非常显著。我们还从溶剂化的角度探讨了AGP-Ca²⁺的相互作用。事实上，越来越多的证据表明，熵驱动的脱水作用而非单纯的库仑相互作用是许多带电生物聚合物（如肝素、牛奶酪蛋白）与Ca²⁺结合的关键驱动力（Canabady-Rochelle等人，2009a；Canabady-Rochelle等人，2009a；Knight等人，2025年）。例如，Ca²⁺与聚半乳醛酸结合的ITC热图显示了两个连续的结合阶段：第一阶段是阳离子和羧酸的脱水（由焓变驱动），形成单体复合物（K_a1 = 2.8 × 10⁵ M^?1）；第二阶段（同时受熵变和焓变驱动）是聚半乳醛酸链的二聚化（K_a2 = 3.3 × 10⁴ M^?1）。类似的两步结合行为也在Ca²⁺与海藻酸钠和低甲氧基果胶的相互作用中观察到（Assifaoui等人，2015年；De，2003年；Fang等人，2007年）。相比之下，Mg²⁺与聚半乳醛酸的结合被认为是熵驱动的，其结合常数K_a低一个数量级（K_a = 2.5 × 10³ M^?1），并且在分子动力学模拟中未观察到链二聚化。二价阳离子对水的亲和力被认为在其与聚半乳醛酸的相互作用中起关键作用（Huynh等人，2016年）。Mg²⁺比Ca²⁺更高的脱水焓可能阻碍了其与聚半乳醛酸的强结合（Smith，1977年）。

更好地理解Ca²⁺的结合机制不仅具有学术意义，还对基于金合欢胶的工业配方具有重要意义。例如，胶体分散液中内源性Ca²⁺的存在会导致饮料行业中色素的不希望的沉淀（Fang等人，2007年），而Ca²⁺的体外结合可能影响膳食Ca²⁺的生物利用度（Kolb & Kunkel，1994年）。最近，由于金合欢胶在宽pH范围内的强钙结合能力，它也被用作防垢剂（Zhang等人，2025年）。

为填补这些知识空白，我们使用等温滴定量热法（ITC）和双电极电位滴定系统定量表征了Ca²⁺与两种金合欢胶（A. senegal和A. seyal）之间的相互作用，该系统能够实时监测游离Ca²⁺和释放的质子。通过带耗散的石英晶体微天平（QCM-D）评估了AGP大分子在Ca²⁺结合后的构象变化。这种综合方法首次直接揭示了金合欢胶与Ca²⁺之间pH依赖性相互作用的热力学特性。

材料

A. senegal（批号：OF152413）和A. seyal（批号：OF110724）胶粉由Alland & Robert Company（法国Port Mort）提供。为了制备脱矿（DM）胶粉，将A. senegal或A. seyal胶粉分散在Milli-Q水中（pH 4.6），浓度为16 wt%，并在250 rpm下使用磁力搅拌器搅拌过夜，以确保胶粉完全水合。随后使用离子交换树脂去除A. senegal或A. seyal胶中的阳离子。

研究金合欢胶的特性

在本研究中，我们考察了两种金合欢胶在不同pH值下的Ca²⁺结合过程。通过HPSEC-MALLS测定了A. senegal和A. seyal胶中AGPs的结构参数。图1展示了洗脱曲线，完整的数据集（包括带电氨基酸残基和单糖的含量）见表1。A. senegal胶的平均重量平均分子量为4.52 × 10⁵ g mol^?1

结论

本研究通过双电极电位滴定、ITC和QCM-D研究了脱矿后的A. senegal和A. seyal胶与Ca²⁺的结合机制。电位滴定显示，Ca²⁺的结合能力在pH 7.0时分别为12.7 mg g^?1和13.4 mg g^?1，相当于每个羧基结合一个Ca²⁺离子；随着pH值从7.0降至3.0，结合的Ca²⁺逐渐减少。

CRediT作者贡献声明

郝莉：撰写初稿、方法论设计、实验设计、数据分析、概念构建。迈克尔·尼根：撰写、审稿与编辑、监督、概念构建。克里斯蒂安·桑切斯：撰写初稿、监督、概念构建。丹尼斯·雷纳尔：撰写、审稿与编辑、监督、概念构建。

资助

本研究得到了Alland and Robert Company的财政支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Luc Saulnier（INRAE，UR BIA）在HPSEC-MALLS测量和分析方面提供的技术和科学支持。