《Forensic Science International》：Method design and automation of a forensic toxicology LC-QTOF-MS technique to meet high-throughput routine applications
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本文提出并验证了一种基于LC-QTOF-MS的自动化数据处理框架，集成质量保证规则，显著缩短了法医毒理检测批次处理时间（从数天降至3小时），同时提升结果一致性、合规性，并为未来引入高级计算方法奠定基础。
Maria Sarkisian | Megan Farley | Luke N. Rodda
美国加利福尼亚州旧金山Newhall街1号，首席法医办公室
摘要
如果没有整体的方法设计和自动化的数据处理，全面且经过验证的分析技术的效用将大打折扣。法医毒理学实验室需要既分析严谨又在法律上可辩护的工作流程。然而，传统的数据处理受到人工审核、软件限制以及案件复杂性增加的制约。为了解决这些挑战，我们开发并验证了一种方法设计和自动化数据处理框架，用于之前发表的液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）技术，以支持高通量毒理学分析，并将实验室的质量保证程序嵌入其中。该系统在供应商软件中集成了查找表、自定义计算和自动标记规则，用于评估校准、保留时间、内标稳定性、质量控制性能和测量不确定性。其模块化设计实现了自动化数据解析、与参考标准的比较评估、定量测定以及异常处理，结果以与实验室信息和案件管理系统兼容的标准格式输出。实施后，每批样本的审核时间从几天缩短到了三小时，同时提高了一致性、重复性，并符合ANSI/ASB标准054和ISO/IEC 17025:2017的要求。这一框架展示了自动化如何同时提高法医毒理学的效率、合规性和可辩护性，并为未来与先进的计算和机器学习应用的集成提供了可扩展的基础。
引言
法医毒理学实验室必须遵守严格的质量保证（QA）标准，以产生分析严谨且在法律上可辩护的结果。然而，由于软件限制，复杂数据的人工审核仍然劳动密集、主观性强，并且随着案件量和化合物范围的扩大而变得越来越困难[1]、[2]、[3]。尽管其他分析领域已经在自动化数据处理工作流程方面取得了成功[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]，但在法医毒理学中的类似详细应用仍然有限[10]、[11]、[12]。现有文献几乎没有提供关于实验室如何实施自动化或构建其数据处理策略的见解。出版物通常描述分析方法和验证过程，但忽略了底层的工作流程设计、计算逻辑和质量保证集成。现有的供应商工具和技术说明往往缺乏定制性、验证或实际应用，导致实验室不得不通过大量手动干预来适应默认系统。
最近，我们发表了一种液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）方法，该方法可以检测血液和尿液中的946种药物和代谢物，适用于实验室接收的所有案件[13]。该技术具有全面性和灵敏度，涵盖了广泛的药物类别，检测限适用于尸检毒理学、药物影响驾驶（DUID）和药物辅助性侵犯（DFSA）调查。对鉴定标准的广泛验证进一步增强了分析的信心和法医的可辩护性[14]。尽管该技术在分析和鉴定方面具有强大的能力，但手动审核典型的30个样本批次在日常操作中是不可持续的，分析师需要花费两到三天的时间来仔细评估空白样本、质量控制（QC）和未知样本，涉及多个参数，包括面积比（AR）、保留时间（RT）、内标和鉴定标准。这种程度的审核容易出错，尤其是在案件复杂性增加和分析师因重复性手动评估而疲劳的情况下。没有自动化，通量受到限制，不同分析师之间的结果一致性可能发生变化，报告延迟也可能发生——这些障碍表明法医毒理学需要 streamlined 和标准化的数据处理框架。
为了解决这些挑战，我们旨在开发一个设计良好的方法工作流程，包括直接集成到供应商软件平台中的自动化数据处理。该方法包括自定义查找表、计算、自动标记规则、注释和报告功能，用于评估QC性能，将鉴定标准应用于案件中的分析物，并实时突出异常值。通过自动化这些关键步骤，该方法减少了人工审核时间，确保了QA标准的一致应用，并以标准化格式输出结果，便于立即报告。重要的是，该系统的设计符合ANSI/ASB标准054[15]和ISO/IEC 17025:2017[16]的要求，将合规性嵌入到处理流程中。本文描述了之前发表的全面LC-QTOF-MS方法的自动化框架的设计、实施和验证，实现了高通量数据处理，确保了自动符合质量保证要求，并将批次级别的处理时间从几天缩短到了几小时。
部分摘录
仪器和数据采集
所有分析均使用LC-QTOF-MS进行，采用之前描述的样品提取方法、顺序窗口采集所有理论碎片离子谱（SWATH）和鉴定标准[13]。仪器校准、调谐和常规维护按照制造商建议和内部实验室协议进行。每次检测前，通过质谱调谐检查和参考标准分析来验证仪器性能
结果
自动化处理框架已在常规案件中实施和测试，以评估其在分析工作流程所有阶段的性能。结果按照实验部分描述的模块化设计呈现，并显示在图1和补充表I中，每个模块分别针对质量保证或数据评估的特定组成部分。这些模块共同展示了自动化解析、比较评估和定量框架的作用
讨论
确保法医毒理学结果能够经受住分析审查和法律挑战，不仅取决于测试方法的严谨性，还取决于支持它的QA流程的完整性。实际上，维持这种监督水平面临重大的操作挑战。每批案件必须在多个维度上进行评估，包括校准准确性、QC性能、鉴定可靠性和内标稳定性。这需要
结论
虽然我们之前开发了一种可以检测血液和尿液中近1000种分析物的全面方法，与其他法医毒理学实验室一致，但处理HRMS数据仍需要几天时间才能得到结果，并且容易出错，存在漏检阳性结果的情况，同时也缺乏必要的质量合规措施。随后，这种用于高通量法医毒理学的自动化数据处理框架的开发证明了效率的提高
CRediT作者贡献声明
Luke N. Rodda：撰写原始草稿、监督、项目管理、方法论、概念化。Maria Sarkisian：撰写原始草稿、方法论、正式分析、数据整理、概念化。Megan Farley：方法论、概念化。
资金支持
本工作得到了加利福尼亚州公共卫生部物质和成瘾预防部门提供的“增强型法医毒理学项目——过量预防计划”资助（资助编号：23-10632）的支持。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Maria Sarkisian报告称获得了加利福尼亚州公共卫生部的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Janna Anichina、Vanaja Raguvaran、Sonny Sampson、Pierre Negri和Kevin He在调整和扩展软件功能以满足法医毒理学数据处理工作流程需求方面提供的支持。
