《Horticultural Plant Journal》：Transcriptional repression of an ABC transporter gene
OfABCG13 by AP2/ERF transcription factor OfERF177 attenuates floral aroma emission in
Osmanthus fragrans
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花香的挥发调控机制尚不明确。本研究聚焦著名香花木本植物桂花，系统鉴定了其ABC转运蛋白家族，并发现位于细胞膜的ABCG亚家族成员OfABCG13的表达与萜类挥发物释放水平呈高度正相关。功能验证表明，OfABCG13可显著促进花香挥发。进一步研究揭示，AP2/ERF家族转录因子OfERF177通过直接结合OfABCG13启动子抑制其表达，从而负调控花香释放。该研究首次报道了OfERF177-OfABCG13转录模块调控花香释放的新机制，为改良园艺作物香气品质提供了新策略。
每年金秋时节，馥郁的桂花香总能沁人心脾，这种独特而浓郁的香气主要来源于花朵释放的挥发性萜类化合物。花香不仅是植物吸引传粉者、抵御植食者的“化学语言”，也是决定园艺作物观赏与风味品质的关键性状。然而，花香物质的生物合成途径已有较多研究，但它们在细胞内合成后，如何跨越细胞膜被释放到环境中的分子调控机制，在木本芳香植物中仍不清晰。尤其对于像桂花这样的重要经济与观赏树种，深入解析其花香释放的调控网络，对于定向培育香气更浓郁的品种具有重要意义。
近日，南京林业大学 Yue Yuanzheng, Wei Hao 等研究者在《Horticultural Plant Journal》上发表了一项研究，系统揭示了桂花花香释放的一个关键调控模块。该研究围绕一个核心科学问题展开：在桂花中，究竟是哪些分子“搬运工”负责将花香物质运出细胞，而这些“搬运工”的活动又受到怎样的精密调控？
为了回答这一问题，研究人员开展了一系列系统的研究工作。他们首先在桂花基因组中全基因组鉴定了ATP结合盒转运蛋白家族，并锁定了一个在花组织中特异性高表达、且表达量与萜类挥发物释放动态高度正相关的候选基因 OfABCG13。随后的功能实验证实，OfABCG13是一个定位于细胞膜的“转运工”，其过量表达能显著提升烟草和桂花本氏花中萜类化合物的释放总量。那么，谁在控制这位“搬运工”的产量呢？通过酵母单杂交筛选等技术，研究人员找到了它的“上级指挥”——一个名为OfERF177的AP2/ERF家族转录因子。分子互作实验证明，OfERF177能够直接结合到 OfABCG13 基因的启动子区域，并抑制其转录活性。当在桂花花朵中利用病毒诱导的基因沉默技术降低 OfERF177 的表达时， OfABCG13 的表达量随之上升，花朵释放的萜类香气物质也显著增加。有趣的是，研究还发现OfERF177同时也能抑制另一个花香生物合成关键基因 OfCCD4 的表达。该研究最终描绘出一个清晰的调控模型：转录因子OfERF177通过同时抑制转运蛋白基因 OfABCG13 和生物合成基因 OfCCD4 的表达，在“生产”和“运输”两个层面协同负调控桂花花香的最终形成与释放。
本研究运用了多种关键实验技术。在材料方面，使用了桂花品种‘日香桂’五个花发育阶段的花朵以及烟草转基因材料。在基因功能研究上，采用了亚细胞定位、稳定及瞬时转基因过表达、以及病毒诱导的基因沉默技术。在分子机制解析层面，综合运用了酵母单杂交、双荧光素酶报告基因检测以及凝胶迁移阻滞实验，验证了转录因子与靶基因启动子的直接结合与调控关系。挥发性有机化合物的定性与定量分析则通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术完成。
3.1. Identification of ABC transporter genes from O. fragrans
研究人员从桂花基因组中系统鉴定出168个ABC家族成员，预测其蛋白质主要定位于细胞膜，为后续筛选参与花香释放的候选基因奠定了基础。
3.2. Phylogenetic analysis, gene structure, and conserved motif identification of OfABCs
进化树分析将168个OfABCs分为A-G和I共8个亚家族，其中ABCG亚家族成员最多（71个）。保守基序分析显示，所有蛋白都包含核苷酸结合结构域的高度保守基序，如Walker A、Walker B和ABC签名基序。
3.4. Expression of OfABCs in different tissues and developmental stages
表达模式分析发现， OfABCG13、OfABCG34 和 OfABCG52 在花组织中特异性高表达，且其表达在花发育阶段（S1-S4）持续维持在高水平，暗示它们可能与花发育或花香释放相关。
3.6. Identification of OfABCGs involved in terpenoids emission
相关性分析显示， OfABCG13 和 OfABCG52 的表达水平与五个花发育阶段萜类化合物含量呈显著正相关。亚细胞定位实验证实OfABCG13和OfABCG52蛋白定位于细胞膜，符合膜转运蛋白的特征。
3.7. Overexpression of OfABCG13 enhances terpenoids emission in tobacco
在烟草中稳定过表达 OfABCG13 能显著提高转基因花朵中萜类化合物的总释放量，而过表达 OfABCG52 则无此效果，初步证明OfABCG13在促进萜类挥发物释放中具有特异性功能。
3.8. Overexpression of OfABCG13 enhances terpenoids emission in O. fragrans
在桂花花朵中瞬时过表达 OfABCG13 同样能显著增加萜类化合物的释放，进一步在宿主植物中验证了OfABCG13在花香释放中的关键作用。
3.9. Screening the candidate transcription factors regulating OfABCG13
以 OfABCG13 启动子为诱饵，通过酵母单杂交技术从桂花花cDNA文库中筛选出其上游转录因子OfERF177。验证实验表明OfERF177定位于细胞核，具有转录激活活性，并能直接结合 OfABCG13 启动子。
3.10. OfERF177 represses OfABCG13 expression by directly binding to its promoter
双荧光素酶报告基因实验证明OfERF177能够抑制 OfABCG13 启动子的活性。表达模式分析显示 OfERF177 与 OfABCG13 在花发育过程中呈负相关。凝胶迁移阻滞实验进一步证实OfERF177蛋白可直接结合 OfABCG13 启动子上的ACCGAC motif。
3.11. Silencing of OfERF177 enhanced the terpenoids emission in O. fragrans flowers
在桂花花朵中沉默 OfERF177 基因，导致其下游靶基因 OfABCG13 的表达量显著上调，同时花朵中萜类香气物质的释放总量也明显增加，从反向遗传学角度证实了OfERF177对花香释放的负调控作用。
3.12. Expression analysis of terpenoids biosynthesis genes in OfERF177 silenced flowers
研究发现，在 OfERF177 沉默的花朵中，不仅 OfABCG13 表达上调，参与β-紫罗兰酮生物合成的关键基因 OfCCD4 的表达也显著增加。后续实验证明OfERF177也能直接结合并抑制 OfCCD4 启动子的活性，表明OfERF177同时调控香气物质的“运输”和“合成”两个环节。
本研究的主要结论与意义在于，首次在桂花中系统解析了一个调控花香释放的转录模块。研究人员鉴定出ABCG亚家族转运蛋白OfABCG13是花香萜类化合物释放的关键正调控因子，它如同一个位于细胞膜上的“香气出口泵”。而其上游的AP2/ERF家族转录因子OfERF177，则扮演了“总开关”的角色，它通过直接结合 OfABCG13 基因的启动子，抑制其表达，从而减少香气物质的“泵出”。此外，OfERF177还能抑制花香生物合成关键基因 OfCCD4 的表达。因此，OfERF177通过对 OfABCG13 和 OfCCD4 的双重抑制，在“合成”与“释放”两个层面协同下调桂花花香的最终强度。
这一发现具有重要的科学意义与应用价值。在理论上，它首次揭示了AP2/ERF转录因子通过调控ABC转运蛋白来影响花香释放的分子机制，拓展了人们对花香形成复杂调控网络的认识， particularly in woody aromatic plants。在实践上， OfERF177-OfABCG13 这一关键调控模块的发现，为通过基因编辑或分子育种手段精准调控园艺作物、特别是木本香花植物的香气释放强度与模式提供了潜在的靶点。通过抑制 OfERF177 的表达或功能，或许能够培育出花香更浓郁、持久的桂花乃至其他观赏植物新品种，从而提升其观赏价值与经济价值。
