《Horticultural Plant Journal》：The VvSEP3-VvCCD1b transcriptional module regulates carotenoid degradation in grape
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本研究聚焦葡萄果实芳香品质形成的分子机制，探讨了调控类胡萝卜素降解的关键转录模块。研究人员通过系统鉴定葡萄类胡萝卜素裂解双加氧酶基因家族，揭示了VvCCD1b在果实成熟期的核心功能，并首次发现MADS-box转录因子VvSEP3可定位于细胞核，直接结合并激活VvCCD1b启动子，从而形成一个整合发育信号与次级代谢的全新调控通路。该研究阐明了葡萄香气物质（如降异戊二烯）积累的分子基础，为分子育种改良果实品质提供了重要靶点。
葡萄，这一风靡全球的“浆果之王”，其魅力不仅在于多汁的果肉，更在于其复杂而迷人的香气。无论是酿造成醇厚的美酒，还是作为鲜食水果，独特的香气都是决定其风味品质和商业价值的关键。在构成葡萄香气的众多化合物中，有一类被称为降异戊二烯的物质扮演着核心角色，它们正是由另一类我们熟知的天然色素——类胡萝卜素降解而来。类胡萝卜素不仅是赋予植物金黄、橙红色泽的“调色师”，在光合作用中也至关重要。然而，在葡萄果实成熟过程中，类胡萝卜素含量为何会下降，而其降解产物降异戊二烯的香气物质又如何积累，其背后的分子调控机制一直是个“黑箱”。尽管科学家们知道类胡萝卜素裂解双加氧酶是催化这一过程的关键“剪刀手”，但对于葡萄中这类“剪刀手”家族的全貌，以及是谁在指挥这些“剪刀手”在特定时间、特定部位工作，我们知之甚少。尤其缺乏对其上游转录调控因子的清晰认识。为了破解葡萄果实香气形成的核心密码，并为分子育种精准改良品质提供理论依据，来自南京农业大学的研究团队开展了一项系统性的研究，相关成果发表在《Horticultural Plant Journal》上。
为了探究上述科学问题，研究人员综合运用了多组生物信息学分析与分子生物学技术。他们首先利用公共基因组和转录组数据库，对葡萄类胡萝卜素裂解双加氧酶基因家族进行了全基因组鉴定与表达谱分析。研究选取了‘巨峰’、‘阳光玫瑰’、‘巨玫瑰’和‘沪太8号’四个不同果皮颜色的葡萄品种，在四个关键发育阶段（果实膨大期、软化前期、软化后期、完熟期）系统测定了类胡萝卜素（叶黄素、β-胡萝卜素）和降异戊二烯含量，并通过定量实时PCR检测了关键基因的表达模式。为了验证基因功能，研究采用了农杆菌介导的瞬时转化技术，在烟草叶片和‘夏黑’葡萄果实中分别过表达了目标基因VvCCD1b和VvSEP3，并分析了转基因材料的表型、基因表达及代谢物变化。此外，通过亚细胞定位、凝胶阻滞迁移实验和双荧光素酶报告基因检测等分子互作技术，深入解析了转录因子VvSEP3对下游靶基因VvCCD1b的直接调控机制。
3.1. 葡萄VvCCD基因的鉴定与特征分析
研究人员从葡萄基因组中系统鉴定出13个VvCCD基因，并对其染色体定位、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件和系统进化关系进行了全面分析。结果表明，VvCCD基因在染色体上分布不均，其中VvCCD1a和VvCCD1b、VvCCD4a和VvCCD4b可能来源于串联复制事件。进化树分析将这些蛋白分为VvCCD和VvNCED两大亚家族，其中VvCCD亚家族又进一步分为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8和CCD-like五个分支，揭示了该基因家族的功能分化。
3.2. 葡萄VvCCD基因的时空表达模式
基于公共转录组数据的分析显示，不同的VvCCD基因具有组织特异性和发育阶段特异性表达模式。其中，VvCCD1b在葡萄果实多个发育阶段均表现出较高的表达量，VvCCD1a、VvCCD4a和VvCCD4b也在果实中高表达，而VvNCED1和VvNCED2在坐果期表达最高。这些表达模式在多个独立数据集中均得到验证，提示不同成员在葡萄不同组织和发育过程中扮演着多样化角色。
3.3. 葡萄果实发育过程中类胡萝卜素含量与VvCCD表达相关
通过对四个葡萄品种果实发育过程的代谢物与基因表达关联分析发现，主要类胡萝卜素（叶黄素和β-胡萝卜素）的含量随果实成熟而持续下降，而降异戊二烯类物质则呈现积累趋势。基因表达分析显示，VvCCD1a、VvCCD1b、VvCCD4a和VvCCD4b的表达水平在发育后期上调，与类胡萝卜素含量呈负相关，与降异戊二烯含量呈正相关；而VvNCED1和VvNCED2则呈现相反的表达模式。
3.4. 过表达VvCCD1b降低烟草叶片和葡萄果实中的类胡萝卜素含量
为验证VvCCD1b的功能，研究团队在烟草叶片和‘夏黑’葡萄果实中瞬时过表达了VvCCD1b。虽然未观察到明显的表型变化，但高效液相色谱分析证实，过表达VvCCD1b能显著降低烟草叶片和葡萄果皮中叶黄素和β-胡萝卜素的含量，直接证明了VvCCD1b在植物体内催化类胡萝卜素降解的功能。
3.5. 葡萄VvMADS基因的鉴定与特征分析
鉴于在VvCCD1b启动子中发现了MADS-box转录因子的结合位点，研究人员进一步鉴定了11个葡萄VvMADS基因，并分析了它们的蛋白特性、基因结构、保守基序和启动子顺式元件，为寻找VvCCD1b的上游调控因子奠定了基础。
3.6. VvMADS基因的表达模式及其与VvCCD1在果实发育过程中的相关性
表达模式分析发现，MADS-box转录因子VvSEP3的表达量在果实发育过程中逐渐升高直至成熟，且与VvCCD1b的表达呈显著正相关，提示VvSEP3可能是VvCCD1b的潜在调控因子。
3.7. 过表达VvSEP3降低烟草叶片和葡萄果实中的类胡萝卜素含量
功能验证实验表明，在烟草叶片中过表达VvSEP3能降低类胡萝卜素含量，但未影响烟草内源CCD1b的表达，暗示可能存在物种特异性或其它调控途径。而在‘夏黑’葡萄果实中过表达VvSEP3，则能显著上调VvCCD1b的表达，并导致叶黄素和β-胡萝卜素含量下降，证明了VvSEP3在葡萄同源系统中对类胡萝卜素代谢的调控作用。
3.8. VvSEP3定位于细胞核并直接结合并激活VvCCD1b的启动子
分子机制研究表明，VvSEP3蛋白定位于细胞核。进一步的凝胶阻滞迁移实验证明，纯化的VvSEP3蛋白能够直接、特异地结合到VvCCD1b启动子区的CArG-box元件上。双荧光素酶报告基因实验则证实，VvSEP3能够显著激活由VvCCD1b启动子驱动的荧光素酶报告基因表达。这些结果从分子水平上完整地证实了VvSEP3作为转录激活子直接调控VvCCD1b转录的机制。
综合以上结果，本研究的结论与意义是清晰而深远的。研究首次在葡萄中系统鉴定了包含13个成员的VvCCD基因家族，并揭示了它们在果实发育过程中的差异化表达模式。研究不仅确认了VvCCD1b是葡萄果实成熟过程中催化类胡萝卜素降解、促进降异戊二烯香气物质形成的关键酶基因，更重要的是，发现并证实了一个全新的转录调控模块：VvSEP3-VvCCD1b。该模块的运作机制是，MADS-box转录因子VvSEP3在果实发育晚期表达升高，进入细胞核后，直接结合到下游靶基因VvCCD1b的启动子特定区域，激活其转录，从而增强类胡萝卜素的降解代谢流，最终促进香气物质的积累。
这项研究的意义在于，它成功地将植物发育生物学（由MADS-box基因介导的发育程序）与次级代谢调控（类胡萝卜素降解途径）联系起来，阐明了葡萄果实香气形成这一重要品质性状背后的核心分子开关。这一发现突破了以往对类胡萝卜素代谢调控网络的认知，为通过分子设计育种精准调控葡萄果实香气成分提供了明确的理论基础和关键的基因靶点。例如，未来可以通过基因编辑或启动子工程技术，对VvSEP3或VvCCD1b进行定向改良，从而培育出香气更加浓郁、品质更优的葡萄新品种，具有重要的科学价值和应用前景。
