《Horticultural Plant Journal》：JrWRKY76 negatively regulates JrPTI4-mediated transcription of
JrPR1 to affect walnut resistance against bacterial blight
编辑推荐：
本文聚焦核桃细菌性疫病（由 Xanthomonas arboricolapv. Juglandis引起）这一严重威胁我国核桃生产的病害。研究通过转录组测序、基因功能验证及分子互作实验，发现 JrPTI4 能正调控病程相关基因 JrPR1的表达，而 JrWRKY76 与 JrPTI4 互作并抑制其转录激活作用。该成果为解析核桃抗病分子网络提供了新见解，并为抗病育种提供了潜在靶点。
核桃作为我国重要的木本油料树种，不仅具有极高的经济价值，也因其丰富的营养价值而备受青睐。然而，核桃生产长期面临一项严峻挑战——由 Xanthomonas arboricolapv. Juglandis（Xaj）引起的核桃细菌性疫病。这种病害会导致叶片萎蔫、果实腐烂，造成严重的经济损失。目前，化学防治是主要手段，但其效果常因病原菌产生抗药性以及环境问题而大打折扣。因此，选育抗病品种成为核桃产业可持续发展的一项关键策略。尽管核桃基因组已经测序，但其抗病基因的功能研究和抗病信号通路仍不清晰，尤其是模式触发免疫（Pattern-triggered immunity, PTI）通路中关键转录因子的作用尚待探索。
在此背景下，研究人员以高感病品种‘香玲’核桃为材料，开展了一项深入的研究，旨在揭示核桃应对细菌性疫病的分子机制。他们重点关注了一个名为 JrPTI4 的转录因子。PTI4属于乙烯响应因子（Ethylene response factor, ERF）家族，是植物免疫信号通路中的下游组分。本研究最终发现，JrPTI4能够正向调控核桃的抗病性，而另一个转录因子 JrWRKY76 则会通过与JrPTI4相互作用，负向调控这一过程，从而精细调控核桃的免疫反应。相关研究成果发表在《Horticultural Plant Journal》上。
为了探究JrPTI4的功能，研究人员运用了多种分子生物学和遗传学技术。他们首先通过转录组测序分析了病原菌侵染后核桃叶片中的基因表达变化。在此基础上，利用基因过表达和病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS） 技术，分别在84K杨树和核桃本株中验证了JrPTI4的功能。为了寻找与JrPTI4相互作用的蛋白，他们构建了核桃cDNA文库并进行酵母双杂交（Yeast two-hybrid, Y2H） 筛选，并通过双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC） 实验在体内验证了蛋白互作。此外，酵母单杂交（Yeast one-hybrid, Y1H） 和双荧光素酶报告基因（Dual-luciferase reporter） 实验被用于研究JrPTI4及其互作蛋白对下游靶基因 JrPR1启动子的转录调控活性。研究人员还通过农杆菌介导的遗传转化获得了过表达 JrWRKY76的转基因水稻，以初步探索该基因的其他功能。
3.1. JrPTI4在核桃中的鉴定与表达
研究人员通过生物信息学分析发现，JrPTI4蛋白包含一个典型的AP2结构域，与番茄的SlPTI4同源性最高。转录组数据显示，在接种Xaj后第1天，JrPTI4的表达量显著上调，随后逐渐下降，表明它可能在病原菌入侵早期发挥作用。亚细胞定位实验证实JrPTI4定位于细胞核。
3.2. JrPTI4在84K杨树中的异源过表达增强了抗病性
为了验证JrPTI4的功能，研究团队在84K杨树中过表达了 JrPTI4。结果表明，过表达植株中 JrPR1和 PR10的表达上调，而 PR3的表达下调。当用病原菌 Melampsora magnusiana接种时，过表达植株的病斑面积和数量显著少于野生型。同时，过表达植株的防御酶（如PAL、SOD、POD、CAT）活性更高，而膜脂过氧化产物MDA含量更低，这些都表明JrPTI4增强了植物的抗病性。
3.3. 沉默JrPTI4基因增加了核桃对病原菌的敏感性
利用VIGS技术在核桃中沉默 JrPTI4后，植株生长变缓、矮化。当分别接种真菌 Colletotrichum gloeosporioides和细菌Xaj后，沉默植株叶片上出现了明显且严重的病斑，而野生型植株病状较轻。这直接证明了 JrPTI4基因在核桃抵抗多种病原菌中起着正调控作用。
3.4. JrPTI4互作蛋白的筛选与验证
通过酵母双杂交筛选核桃cDNA文库，研究人员找到了5个可能与JrPTI4相互作用的蛋白，其中包括一个WRKY家族转录因子 JrWRKY76。进一步的酵母双杂交和BiFC实验均证实了JrPTI4与JrWRKY76在体内外存在直接的蛋白互作。
3.5. JrPTI4与JrWRKY76的相互作用影响JrPR1的表达
JrPR1基因的启动子区含有GCCGAC motif（顺式作用元件）。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验证明，JrPTI4能够直接结合该 motif 并正调控 JrPR1的转录。然而，当共转染JrWRKY76时，这种激活作用被显著抑制。同时，在病原菌侵染后，JrWRKY76的表达量急剧下降。这些结果表明，JrWRKY76通过与JrPTI4互作，抑制了后者对 JrPR1的转录激活。
在讨论与结论部分，本研究系统地阐明了JrPTI4在核桃抗病中的核心作用及其调控机制。JrPTI4作为核定位的转录因子，通过激活 JrPR1等病程相关基因的表达来增强核桃对 C. gloeosporioides、Xaj 和 M. magnusiana的抗性。研究首次发现并证实了 JrWRKY76 作为转录抑制因子，能够与 JrPTI4 相互作用，从而负调控 JrPR1的转录。研究者提出了一个动态调控模型：在正常情况下，JrWRKY76 表达量较高，通过与 JrPTI4 结合抑制免疫反应，维持植物稳态；当病原菌入侵时，JrPTI4表达上调，同时 JrWRKY76表达下降，解除了其对 JrPTI4 的抑制，使得更多的自由 JrPTI4 得以激活 JrPR1等防御基因，启动免疫应答。这一发现揭示了核桃免疫系统中一个精妙的“刹车”机制，即通过转录因子间的互作来平衡免疫反应与生长发育。该研究不仅深化了对植物尤其是木本植物抗病分子机制的理解，也为通过分子育种手段（如编辑 JrWRKY76以释放 JrPTI4 的抗病潜能）培育抗细菌性疫病的核桃新品种提供了重要的理论依据和候选基因靶点。
