《Human Immunology》：Beyond HLA: An adaptive nanopore sequencing assay for simultaneous HLA and blood group profiling in transplantation
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本研究针对移植前传统基因评估（集中于ABO和11个HLA基因）的局限性，开发了一种基于牛津纳米孔技术（ONT）自适应采样（adaptive sampling）的、无需预扩增的全新检测方法。该方法可同步、高深度覆盖完整HLA基因座和国际输血学会（ISBT）所有已知血型系统基因，在4天内完成分型，其数据质量与传统金标准方法相当或更优，为个性化的移植风险评估提供了高效、可扩展的概念验证。
器官移植是拯救生命的疗法，但它伴随着排斥反应、移植物抗宿主病、感染和恶性肿瘤等重大风险，这些并发症源于受者免疫系统与移植器官的相互作用。为了预防免疫损伤，患者需要长期服用具有毒副作用的药物。传统的移植前基因评估主要聚焦于ABO血型和11个人类白细胞抗原（HLA）基因。然而，随着技术进步，评估更多与移植成功相关的基因已成为可能。当前，ABO血型系统的血清学分型存在局限性，例如平均每1000次检测就会出现一次血清学差异，这可能由弱亚型、不规则抗体等因素引起，并与不良移植结局风险直接相关。同样，HLA分型虽已进入测序时代，但主流方法依赖PCR预扩增，可能引入人为偏好和突变，而杂交捕获等方法又面临探针设计复杂、对高多态性区域捕获效率不均等挑战。那么，是否存在一种方法，能够一次性、无偏倚地精准评估移植免疫相关的多重基因，为患者提供更全面的风险图谱呢？
来自不列颠哥伦比亚大学的研究团队在《Human Immunology》上发表了一项研究，他们利用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）的自适应采样（adaptive sampling）策略，开发了一种全新的概念验证性检测方法。该方法无需PCR预扩增或酶转化，即可在DNA序列和甲基化水平上，同步、高效地对HLA和血型系统基因进行前瞻性分析。这项研究旨在推动移植评估超越传统的靶向ABO和HLA外显子分型，实现对完整HLA基因座（包括内含子、基因间和调控区）以及ABO等其他移植相关基因区域的全面评估。
研究人员开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先，他们使用了ONT的自适应采样进行长读长测序，分别在MinION和PromethION平台上对来自临床实验室的、已知HLA基因型和ABO血型的基因组DNA样本进行了测序，目标区域覆盖了约1%的人类基因组。其次，他们利用生物信息学工具（如RBCeq2、bloodTyper、NGSengine等）对测序产生的数据进行血型基因和HLA基因分型分析。最后，通过将分型结果与实验室原始诊断结果进行盲法比对，以验证该方法的准确性和可靠性。
3. 结果
3.1. 自适应采样参数的优化
为优化目标区域富集效果，研究评估了输入DNA的量与完整性、文库片段大小、测序起始可用孔数、流动池清洗次数和目标区域占基因组百分比等六个参数的影响。优化后的条件使目标区域平均覆盖深度达到全基因组覆盖深度的250倍（中位数250倍），实现了等位基因的单倍型定相，数据质量足以进行基因分型、DNA甲基化分析和变异检测。
3.2. 血型基因分型
研究使用RBCeq2和bloodTyper工具对国际输血学会（ISBT）血型基因进行分型。两种工具基于自适应采样数据所判读的常见和罕见ABO基因型，均与诊断实验室的分型结果一致。在一个样本中，该方法识别出一个与原始记录不同的稀有等位基因（ABO*O.01.75），并通过短读长测序得以确认。在另一个血清学分型模糊的样本中，该方法成功解析出一个新的等位基因。FUT基因的分型结果也与额外的短读长测序数据完全一致。
3.3. HLA基因分型
研究比较了四种可用于处理长读长数据的HLA分型工具。其中，商业软件NGSengine 4.0表现最佳，达到了99%的4字段和100%的3字段一致率。通过对比MinION和PromethION平台的测序数据，研究发现NGSengine 4.0算法对不同的HLA基因效率不同，需要100-200条通过质量控制的靶向读段才能达到100%的4字段一致率，其中HLA-DRB1要求最高，需要约500条比对读段或约50倍的测序深度。同样，使用RBCeq2推断特定ABO基因型也需要约50倍的目标区域覆盖度。
4. 讨论与结论
本研究描述了一种基于纳米孔测序自适应采样的概念验证性移植评估检测方法，用于HLA、ABO及其他血型基因的同时分型。在优化条件下，该方法在单个PromethION流动池上获得的目标区域测序深度和读长质量，超过了可靠变异检测以及同步进行HLA和ABO分型的最低要求。
研究的重要意义体现在以下几个方面：
- 1.
技术优势：与传统的长距离PCR靶向测序相比，自适应采样策略避免了PCR引入的假象，减少了因引物结合位点多态性导致的等位基因丢失，且无需针对每个基因座进行大量的引物优化。与杂交捕获相比，它将复杂性从湿实验的探针设计转移到了软件定义的目标区域，便于根据临床知识的演进快速调整或扩展基因组靶标内容。
- 2.
提升分型质量：该方法能够以约15 kb的读长覆盖完整的HLA基因组区域（包括外显子、内含子和侧翼区），实现完整的单倍型定相。这提高了分型的准确性和精确度，有助于解析复杂的单倍型，减少匹配的模糊性，从而通过减少因模糊性导致的追加检测来支持更快的临床决策。
- 3.
拓展评估维度：该方法能够同时评估多个临床相关基因位点，为复杂的移植环境提供了对常规血清学的实用补充。此外，自适应采样还能以零额外成本捕获DNA甲基化信息，这为未来构建涉及多组学的风险模型或追踪移植后患者的免疫细胞状态提供了可能。
- 4.
推动精准医疗：这项概念验证研究代表了完善精准医学应用的关键一步，旨在改善移植受者的长期预后、降低医疗成本并提高其生活质量和寿命。展望未来，基于杂交捕获、短读长和长读长测序以及纳米孔自适应采样的方法很可能作为互补策略共存，用于全面的移植基因组学评估。
当然，该方法目前也存在一些局限性，如不同流动池之间获得的读深存在运行间差异、相对于传统测序需要较高的DNA输入量等。当前每次检测的成本也高于传统的单一测序检测，但由于能够同时检测多个目标基因，从而将数百个基因分型反应浓缩为一次检测，因此可能很快具备成本效益。总体而言，这项研究为实现更全面、高效、精准的移植前基因组评估提供了新的技术路径和重要概念验证。
