《International Journal of Biological Macromolecules》：Targeting HSP90 destabilization with ganoderic acid a as a novel therapeutic strategy for hepatoblastoma
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灵芝酸A通过靶向降解HSP90α诱导肝母细胞瘤细胞衰老并抑制肿瘤生长。摘要：本研究发现灵芝酸A（GAA）通过诱导肝母细胞瘤（HB）细胞衰老并靶向降解热休克蛋白90α（HSP90α），有效抑制HB细胞增殖、迁移及侵袭，并显著减少荷瘤小鼠肿瘤体积，为HB治疗提供新策略。
宋航|陈凤源|林书月|高航|张正荣|葛阳|叶婷|王子瑜|霍星星|王静辉|刘斌
安徽中医药大学中西医结合医学院，中国安徽省合肥市龙子湖路350号，230012
摘要
背景
肝母细胞瘤（HB）是儿童中最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，其特点是进展迅速且治疗效果不佳。尽管多模式治疗策略有所进展，但高风险或复发的HB患者的预后仍然较差，这凸显了迫切需要新的有效治疗方法。灵芝酸A（GAA）是一种从灵芝（Ganoderma lucidum）中提取的生物活性三萜类化合物，已在多种癌症类型中显示出抗肿瘤活性；然而，其在HB中的治疗潜力和作用机制尚未阐明。
方法
本研究采用综合实验框架，包括体外功能测定、体内异种移植模型和机制研究，以评估GAA对HB的抗肿瘤作用。系统评估了细胞增殖、迁移、凋亡和衰老现象。通过异种移植模型中的生物发光成像技术确定体内治疗效果。同时进行分子对接、分子动力学模拟和基因过表达分析，以阐明GAA的作用分子靶点和机制基础。
结果
GAA通过显著抑制HB细胞的增殖、迁移和侵袭，同时诱导凋亡和细胞衰老，从而表现出显著的抗肿瘤效果。在体内实验中，GAA处理显著减少了HB异种移植模型中的肿瘤负荷。机制研究表明，GAA直接与热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90α）相互作用，导致其伴侣功能受损并促进蛋白酶体介导的降解。重要的是，过表达HSP90能够有效减弱GAA的抗肿瘤效果，表明HSP90是关键的调控因子。分子动力学模拟进一步证实了GAA与HSP90之间的稳定结合和原子级相互作用。
结论
本研究发现GAA通过靶向降解HSP90诱导HB细胞衰老，揭示了一种新的治疗脆弱性。总体而言，这些发现使GAA成为HB靶向治疗的有希望的候选药物，并为其进一步转化开发提供了有力依据。
引言
HB是一种罕见的胚胎性恶性肿瘤，起源于未成熟的肝前体细胞，是儿童中最常见的原发性肝癌，大多数病例在生命的前三年内被诊断出来[1]。目前HB的治疗策略采用化疗、手术切除和靶向治疗等多种方法，这些进展显著提高了临床疗效[2]。然而，包括化疗耐药性、治疗相关毒性和肿瘤复发在内的主要挑战仍未解决，特别是在高风险患者中，这突显了迫切需要新的更有效的治疗策略。
灵芝（Ganoderma lucidum）是一种公认的药用蘑菇，含有多种生物活性成分，如多糖、三萜类和肽类，长期以来因其广泛的药理活性（包括抗炎、保肝、保护心脏和抗肿瘤作用）而受到重视[3]。GAA作为灵芝的主要三萜成分之一，因其多方面的生物活性（包括抗炎、神经保护和心脏保护作用）而受到越来越多的关注[4][5][6]。越来越多的证据表明，GAA的抗肿瘤作用通过多种机制实现，包括抑制肿瘤细胞增殖和侵袭、诱导凋亡以及促进DNA损伤，从而显示出作为抗癌药物的潜力[7][8]。值得注意的是，GAA通过调节肿瘤微环境中的集落刺激因子-1受体依赖的巨噬细胞极化来抑制肝细胞癌（HCC）的生长[9]。作为天然化合物，GAA表现出良好的安全性，副作用最小，表明其适用于儿科肿瘤学研究。然而，GAA在HB中的治疗效果及其作用机制仍大部分尚未探索。
细胞衰老是由各种内在和外在压力引起的永久性和不可逆的细胞周期停滞状态，其特征是明显的形态变化和转录重编程[10][11]。衰老在肿瘤发生中具有双重作用：一方面，它通过阻止恶性细胞的失控增殖起到强大的肿瘤抑制作用；另一方面，衰老细胞通过分泌表型促进肿瘤进展，从而改变肿瘤微环境。越来越多的证据支持将细胞衰老视为癌症的标志，使得调节衰老成为肿瘤学中的新兴治疗策略[12]。事实上，药理学诱导肿瘤细胞衰老已显示出治疗前景；例如，Casticin通过激活Rheb GTP酶诱导衰老，从而抑制肿瘤生长[13]。灵芝传统上与长寿和健康促进相关，其多种成分具有抗衰老作用[14]。有趣的是，有研究表明GAA可以在多个临床前模型中减轻细胞衰老并延缓生理衰退[15]。此外，我们之前发现灵芝多糖可以通过下调组蛋白去乙酰化酶4的表达和促进p16组蛋白乙酰化来诱导细胞衰老，从而抑制HB的进展[16]。然而，GAA是否能在肿瘤细胞中诱导或调节衰老仍不清楚，需要进一步研究。
HSP90是一种高度保守的分子伴侣蛋白，对许多客户蛋白的折叠、稳定和功能维持至关重要，其中许多蛋白是关键的致癌驱动因素[17]。通过稳定这些蛋白，HSP90支持癌症的多个特征，并在肿瘤发生和进展中起关键作用。因此，HSP90已成为一个有吸引力的治疗靶点，几种HSP90抑制剂（如tanespimycin）在临床试验中显示出抗肿瘤活性，包括在HER2阳性转移性乳腺癌中的研究[18]。在HB研究中，HSP90的下调通过减少CDK1表达来抑制肿瘤生长，尽管其确切的分子机制尚未完全明确[19]。除了其致癌功能外，HSP90还参与细胞衰老的调节，根据细胞环境的不同，可能具有促衰老或抗衰老作用[20][21]。例如，17-AAG通过药理学抑制HSP90可延长ERCC1缺陷的早衰小鼠的寿命[20]，而HSP90已被证明可以通过促进p14ARF降解来防止人类肺癌细胞的衰老[22]。尽管有这些发现，HSP90在HB中调节衰老的作用仍需进一步阐明。鉴于GAA和HSP90在细胞衰老中的新兴作用，我们假设HSP90可能参与GAA介导的HB衰老调节。
在本研究中，我们证明了GAA在体外和体内通过诱导细胞衰老发挥强大的抗肿瘤作用。机制上，GAA促进蛋白酶体介导的HSP90降解，从而破坏其伴侣功能。重要的是，过表达HSP90部分逆转了GAA的抗肿瘤效果，证实HSP90是关键的调控因子。总体而言，我们的发现表明GAA是HB治疗的有希望的候选药物，并揭示了HSP90蛋白稳定性与衰老驱动的肿瘤抑制之间的新调控轴。
实验部分
细胞培养和转染
人类HB细胞系HuH6和HepG2从Servicebio（中国）购买，并在添加了10%胎牛血清（FBS；BI，cat#04-001-1ACS）和1%青霉素-链霉素溶液（Beyotime，cat#C0222）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。实验前通过短串联重复序列分析确认了细胞系的真实性。人类正常肝上皮细胞（THLE-2）使用BEGM试剂盒（Lonza）在支气管上皮生长培养基（BEGM）中维持。GAA对HB细胞存活率的抑制作用
GAA的化学结构如图1A所示。为了评估GAA对HB进展的药理作用，本研究用指定浓度的GAA处理正常肝上皮细胞（THLE-2）和HB细胞系（HuH6和HepG2）。如图1B–E所示，GAA以时间依赖的方式显著抑制了HuH6、HepG2和THLE-2细胞的生长。值得注意的是，GAA对HB细胞的抑制作用比对正常肝细胞的抑制作用更强。讨论
本研究发现GAA是一种有效的天然化合物，能够抑制HB的肿瘤发生。我们证明了GAA显著抑制HB细胞的增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡。此外，GAA在HB异种移植模型中显著抑制肿瘤生长，为其在体外和体内环境中的抗肿瘤作用提供了有力证据。值得注意的是，我们的发现进一步表明GAA还能诱导细胞...
CRediT作者贡献声明
宋航：撰写——原始草案、方法学、实验设计。陈凤源：方法学、实验设计。林书月：方法学、实验设计。高航：实验设计、资金获取。张正荣：方法学、实验设计。葛阳：资源准备、数据分析。叶婷：数据可视化、数据分析。王子瑜：方法学、实验设计。霍星星：方法学、实验设计、数据分析。王静辉：监督、概念构思。刘斌：资金提供伦理要求遵守情况
所有关于动物（鱼类）的护理和使用的机构和国家指南均得到遵守。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（批准号：82374210）、安徽省杰出青年研究项目、教育部（批准号：2022AH020042）、安徽省教育厅青年和中年教师培训项目（批准号：JNFX2025022、JWFX2025017）、安徽中医药大学“基础-临床整合”专项计划（批准号：JCLCA2025001）以及安徽省肿瘤重点实验室开放项目的支持。
