: 基于乳蛋白-双重乳液封装体系的粪肠球菌E297益生功能强化研究：耐受性提升、胃肠道保护及其在功能性乳制品中的抗菌应用

《ACS Food Science & Technology》：Encapsulation of Enterococcus faecium E297 by Double Emulsion (W1/O/W2) with Milk Protein Fractions: Stability under Technological and Simulated Digestive Stress, and Antimicrobial Potential in a Functional Dairy Dessert

本文综述了通过水-油-水(W1/O/W2)双重乳液技术，利用乳清蛋白(WY)、酪蛋白(CA)和分离乳清蛋白(WP)对粪肠球菌E297进行封装，以提升其在加工、储存及模拟胃肠道条件下的稳定性。研究表明，特别是酪蛋白(CA)基微胶囊显著增强了益生菌对酸、热、盐等胁迫的耐受性，并在模拟消化中保持了高达83.77%的存活率。在富含蛋白和纤维的功能性乳制甜点中，该封装益生菌不仅保持了≥6.0 log CFU/g的活菌数，还对大肠杆菌(E. coli)展现出高达6.0 log CFU/g的抑制作用，为开发兼具营养与生物保鲜功能的清洁标签乳制品提供了新策略。

　　

本研究聚焦于从巴西圣卡塔琳娜州生牛乳中分离出的粪肠球菌(Enterococcus faecium) E297，旨在通过双重乳液(W₁/O/W₂)微封装技术，利用不同的乳蛋白组分（乳清粉WY、水解酪蛋白CA、分离乳清蛋白WP）作为壁材，以提升该益生菌株在不利环境下的稳定性和功能表现。

首先，研究对E297菌株的益生特性进行了基础表征。该菌株表现出中等的表面疏水性（43.67%），这间接提示了其潜在的肠道粘附能力。在抗菌活性测试中，E297对大肠杆菌(Escherichia coli)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)均显示出抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制效果最为显著。在共培养实验中，E297在培养16小时后能够将大肠杆菌的菌落数减少3.49 log CFU/mL，显示了其强大的竞争抑制潜力。

研究的核心在于封装技术的应用与评价。采用双重乳液法，以大豆油为油相(O)，PGPR为乳化剂，成功制备了包裹E297菌株的微胶囊。封装效率极高，超过90%，且三种壁材之间无显著差异。通过光学显微镜观察，证实了微胶囊的成功形成，其结构为油相中包含多个内部水相(W₁)液滴，外部再由含壁材的水相(W₂)包裹。微胶囊的尺寸分布因壁材而异：WP基微胶囊粒径最小且最集中（主要在10-25 μm）；WY基微胶囊尺寸分布相对均匀；CA基微胶囊则呈现更紧密的结构和双峰尺寸分布。

随后，研究系统评估了封装对E297菌株耐受性的提升效果。在耐盐性（NaCl浓度最高至5%）测试中，封装细胞（尤其是WY和CA）比游离细胞表现出更小的绝对对数减少值，显示了封装对盐胁迫的保护作用。在热耐受性测试（65°C，30分钟）中，封装显著提高了菌株存活率，其中CA基微胶囊的保护效果最佳，在热处理15分钟和30分钟后存活率分别达到82.47%和58.82%。在pH耐受性测试中，封装有效维持了菌株在酸性（pH 2.0和4.0）和中性（pH 7.0）环境下的稳定性，减少了暴露初期的活菌数下降。

储存稳定性实验表明，在-18°C和4°C下储存30天，封装与未封装菌株的存活率均较高。然而，在25°C的室温储存条件下，封装（尤其是CA和WP）的优势得以凸显，能够将菌数维持在高于7.0 log CFU/mL的水平，满足益生菌应用的最低要求。

模拟胃肠道消化测试是评估益生菌口服递送效率的关键。未封装的E297菌株在模拟胃液（pH 2.0）中暴露2小时后，活菌数急剧下降。相比之下，所有封装处理都显著提高了菌株在胃阶段的存活率。其中，CA基微胶囊表现最为出色，在整个240分钟的模拟消化过程中提供了最高水平的保护，并在肠道阶段（180-240分钟）观察到活菌数的恢复性增长，最终存活率达到83.77%。这归因于酪蛋白在胃酸环境下形成凝乳状致密结构，减缓了酸和胃蛋白酶的渗透与攻击。

最后，研究将封装后的E297菌株应用于一款高蛋白、高纤维的功能性乳制甜点中，评估其实际应用潜力。甜点的配方符合高蛋白（19.17 g/100g）和高纤维（8.74 g/100g）的营养声称标准。在4°C冷藏储存5天后，无论是封装还是未封装的E297，其活菌数均能维持在益生菌有效剂量（≥6.0 log CFU/g）以上。更重要的是，在甜点中接入大肠杆菌的挑战性实验中，添加E297菌株（无论是否封装）能够有效抑制病原菌的生长，在储存5天后将大肠杆菌菌数减少高达6.0 log CFU/g。有趣的是，CA封装菌株的抗大肠杆菌效应在初期略有延迟，这可能是由于微胶囊壁材对菌株产生的抗菌代谢物（如有机酸、细菌素等）的释放产生了调控作用，这可能有利于延长产品货架期内的生物保鲜效果。

综上所述，本研究证明，利用乳蛋白（尤其是酪蛋白）通过双重乳液技术封装粪肠球菌E297，是一种高效的技术策略。它能显著增强该益生菌对加工胁迫、环境储存以及模拟胃肠道消化的耐受性，并成功将其应用于功能性乳制品中，在维持自身高存活率的同时，发挥出强大的、针对大肠杆菌的抗菌保鲜功能。这为开发下一代兼具益生健康益处和天然生物防腐功能的“清洁标签”乳制品提供了有力的科学依据和技术路径。未来的研究方向可包括体内功能验证、动态消化模型应用、微胶囊微观结构的深入表征以及工业化放大生产的可行性评估。