《Journal of Structural Biology》：Molecular dynamics simulations refine the pathogenicity of ACVRL1 kinase domain variants by quantifying impacts on ATP binding in pulmonary arterial hypertension
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分子动力学模拟评估ACVRL1 ATP结合域突变功能影响及临床应用。研究通过MD模拟计算ACVRL1-ATP复合物结合自由能，验证了90%已知致病突变（|Δd|≥0.8，p<0.001）的显著功能改变，重新分类63%的VUS为致病性，并成功应用于2例PAH-HHT患者ACVRL1 VUS的功能解析。该模型为 kinase 变异功能评估提供了可扩展工具。
Irina Borovikova|Igor Uporov|Galina Okhrimenko|Vladimir Zamyatin|Elena Dankovtseva|Dmitry Zateyshchikov|Maria Poptsova
国际生物信息学实验室，人工智能与数字科学研究所，俄罗斯高等经济学院（HSE University），Pokrovsky大道11号，109028莫斯科，俄罗斯
摘要
在骨形态发生蛋白（BMP）信号通路中的关键受体ACVRL1的ATP结合域中，单个氨基酸替换通常被归类为意义不明的变异（VUS），这给肺动脉高压（PAH）和遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）的分子诊断带来了复杂性。由于异常的ATP结合会干扰下游的SMAD1/5/8磷酸化，我们采用了分子动力学（MD）模拟来定量评估这些变异的功能影响。首先，我们在20个已知致病性或可能致病的变异上验证了我们的方法，这些变异位于ATP结合位点5?范围内，发现其中18个（90%）导致结合亲和力的显著变化（|d| ≥ 0.8，p < 0.001）。然后，我们将这一方法应用于同一区域内所有已知的VUS、有争议的以及未分类的变异，将32个中的20个（63%）重新分类为可能致病。通过对ATP结合口袋位置的所有可能替换进行全面的计算机模拟突变，并结合HHT表型的InterVar分类，使得12个VUS中的9个（75%）被重新分类为可能致病。最后，我们在两名携带ACVRL1 VUS的PAH患者中展示了这种方法的适用性。本研究确立了ATP结合亲和力的MD模拟作为一种有效且可扩展的工具，可用于解释激酶变异的功能，具有广泛的应用潜力。
引言
肺动脉高压（PAH）是一种严重的致残性疾病，其特征是在左心室充盈压正常的情况下肺血管阻力增加。PAH的发病机制常与转化生长因子-β/骨形态发生蛋白2型受体（TGF-β/BMPR2）信号通路的功能障碍有关。这种通路功能障碍具有遗传基础，因为相当比例的患者携带BMPR2基因的功能丧失突变。
类似激活素A受体1型（ACVRL1）是另一个属于TGF-β信号超家族的基因，其突变与PAH相关，特别是与遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）或Rendu-Osler-Weber病相关。ACVRL1编码ALK1（激活素受体样激酶1），这是一种I型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，主要表达在血管内皮细胞上，在调节血管重塑和血管生成中起关键作用。当BMP9和BMP10等配体结合时，ALK1与II型受体BMPR2和共受体endoglin（ENG）形成异源复合物，激活下游的SMAD1/5/8信号通路，促进内皮细胞静息和血管成熟。
分子动力学（MD）被广泛用于分析蛋白质和核酸的构象动态、研究配体结合机制、预测突变蛋白的稳定性以及模拟膜系统（Diaz等人，2022年）。MD可以提供关于氨基酸替换致病性的机制见解，尤其是那些发生在蛋白质活性位点的替换。
在这里，我们利用MD模拟来评估ACVRL1丝氨酸-苏氨酸激酶域中的单个氨基酸替换如何影响ATP结合。由于ATP作为SMAD转录因子磷酸化的磷酸基团供体，结合效率的变化直接影响SMAD的激活。可以通过计算ACVRL1-ATP复合物的结合自由能来量化突变的影响，这反映了ATP在结合口袋内的稳定性。
由于计算预测工具的支持不足，ACVRL1的ATP结合域中的单个氨基酸替换通常被归类为意义不明的变异（VUS）。VUS分类意味着关于分子改变在疾病中的作用的证据不足或存在矛盾，这给患者咨询和临床管理带来了复杂性。功能数据已被证明是重新分类VUS的最佳证据类型之一，ACMG/AMP框架根据PS3/BS3标准认可了经过充分验证的功能研究作为强有力的证据。然而，对于新出现的或私有的变异，这类检测很少可用。本研究旨在确立基于MD的ATP结合自由能计算作为ACVRL1 VUS重新分类的可重复且可扩展的功能证据标准，并展示其在携带临床意义不明确的VUS的PAH患者中的实用性。
研究队列
研究队列包括两名PAH-HHT患者，其中1名为男性，1名为女性，他们在2014年至2024年间在PH护理中心接受治疗。诊断时的年龄分别为54岁和41岁。平均肺动脉压分别为35毫米汞柱和43毫米汞柱。
测序
使用基于磁珠的吸附方法（MGIEasy Magnetic Beads Blood Genomic DNA Extraction Kit，MGI）提取基因组DNA，随后用于制备测序用的基因组文库。文库制备过程不涉及PCR。
ACVRL1-ATP结构模型的构建与验证
初始模型基于ACVRL1激酶结构（PDB:3MY0），该结构是在ATP结合口袋结合抑制剂LDN-193189的情况下结晶得到的。我们使用PyMol 3.1.3软件去除了抑制剂。通过将ACVRL1激酶结构（PDB:3MY0，296个残基）与丝氨酸-苏氨酸激酶MEK1（PDB:3EQD，313个残基）进行结构对齐来确定ATP的位置，MEK1是在与ATP复合的情况下结晶的（Z-score = 22.3，RMSD = 2.5?，LALI = 242，ID = 23%）（图1）。
结合自由能的计算结果如下：
讨论与结论
我们通过MD模拟全面评估了ACVRL1激酶域ATP结合口袋中的变异对ATP结合亲和力的影响。作为阳性对照，我们使用了公共数据库中报告的所有P/LP变异。我们的分析显示，致病性变异并没有聚集在一起，而是分布在不同的能量水平上，对应于结合力的显著增强或显著减弱，中间状态包括影响可忽略的区域。
CRediT作者贡献声明
Irina Borovikova：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，方法学，研究，形式分析，数据管理，概念化。Igor Uporov：方法学，研究，形式分析。Galina Okhrimenko：验证，方法学，研究，形式分析。Vladimir Zamyatin：方法学，形式分析。Elena Dankovtseva：研究，形式分析，数据管理。Dmitry Zateyshchikov：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目指导
资助
本工作得到了俄罗斯经济发展部为人工智能研究领域提供的资助，依据协议000000C313925P4E0002以及与HSE大学的协议编号139-15-2025-009。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
全基因组测序数据是在Biotech Campus Ltd公司、俄罗斯莫斯科N.E. Bauman领导的HSE大学与第二十九城市临床医院之间的科学合作协议框架下获得的。
