《LWT》：Identification of Two Novel Peptides with Antibiofilm and Antimicrobial Effects from Ovotransferrin Hydrolysates Using Peptidomic and Regression-based Machine Learning Approach
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为了解决食源性致病菌副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)生物膜难以清除、严重影响海产品安全的问题，本研究通过酶解卵转铁蛋白(OVT)获得酶解物(OVH)，利用nanoLC-UHPLC-MS/MS肽组学分析和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等机器学习方法，从中鉴定出两种新型抗生物膜肽PEPVL和PEASY。体外验证显示，在250 μg/mL浓度下，这两种肽可显著抑制生物膜形成(28.62%-91.36%)并减少活菌数，为开发新型食品工业生物膜控制策略提供了创新肽资源与技术路径。
在全球变暖的背景下，一种名为副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)的革兰氏阴性细菌正悄然扩大其领地。它广泛存在于海洋环境及各类海产品中，从章鱼、鱼类到蛤蜊、虾类和贻贝，都可能成为它的藏身之所。人们食用未煮熟或生鲜海产品后，可能面临感染风险。更棘手的是，这种细菌擅长构建名为“生物膜”的“堡垒”——细菌细胞将自己包裹在自身分泌的胞外多糖(EPS)等基质中，紧密黏附在生物或非生物表面。这种“堡垒”能极大地增强细菌对消毒剂和恶劣环境的抵抗力，使得海鲜加工链中的清洗和消毒过程复杂化，严重威胁海产品质量与安全。当前化学消毒剂存在局限性，亟需开发新型、高效的生物膜控制策略。
自然界中，生物体自身产生的抗菌肽(AMP)是潜在的武器库。其中，卵转铁蛋白(Ovotransferrin, OVT)是鸡蛋清中含量丰富的蛋白质，与备受关注的乳铁蛋白结构功能相似，但来源更广、成本更低。通过酶解OVT得到的酶解物(OVH)已知具有多种生物活性，但其针对副溶血性弧菌生物膜的抑制效果及其中起关键作用的活性肽仍知之甚少。为了填补这一知识空白，挖掘OVH作为抗生物膜肽源的潜力，来自鲁东大学的研究团队开展了一项综合性研究，相关成果发表在《LWT》期刊上。
为了开展研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，使用胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)和木瓜蛋白酶(papain)三种酶分别水解卵转铁蛋白，制备了三种OVH。其次，通过结晶紫染色、活菌计数、胞外多糖测定、运动能力测定、自聚集测定等一系列体外模型，系统评估了OVH对三株不同来源副溶血性弧菌生物膜形成多个关键阶段（黏附、聚集、运动、基质产生）的抑制效果。接着，利用纳升级液相色谱-超高效液相色谱-串联质谱(nanoLC-UHPLC-MS/MS)技术对OVH中的肽序列进行了全面的肽组学(peptidomics)表征。进而，创新性地采用有监督的机器学习方法——偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，将质谱数据与抗生物膜活性数据（运动抑制率、自聚集率倒数等）结合，从复杂的肽混合物中筛选出对活性贡献最大的特征肽。最后，对筛选出的候选肽进行固相合成，并验证了其体外抗生物膜和抗菌活性。
研究结果
3.1. 结晶紫测定
通过结晶紫测定评估了OVH的抗生物膜功效。在625-1250 μg/mL浓度下，三种酶解物均能显著降低生物膜生物量，其中胃蛋白酶源OVH在625 μg/mL时对ATCC 17802菌株的生物量减少率达到91.27%。结果表明OVH能有效干扰生物膜的形成。
3.2. OVH对生物膜细胞数量的影响
处理后的生物膜中可培养的活菌数显著减少。1250 μg/mL的胃蛋白酶源OVH使三株菌的生物膜活菌数分别降低了1.89、1.59和1.33 log CFU/cm2。这表明OVH不仅能减少生物膜量，还能直接杀灭或抑制生物膜内的细菌。
3.3. OVH对EPS产生的影响
胞外多糖(EPS)是生物膜基质的关键成分。OVH处理能抑制副溶血性弧菌的EPS合成，其中胃蛋白酶源OVH（1250 μg/mL）对ATCC 17802的EPS抑制率最高，达54.46%。这表明OVH可通过削弱生物膜的“骨架”来抑制其稳定性。
3.4. OVH对运动能力的影响
细菌的运动能力与其在表面定植初期寻找附着点密切相关。OVH能显著削弱副溶血性弧菌的游泳运动(swimming motility)能力，1250 μg/mL胃蛋白酶源OVH对三株菌的运动抑制率在43.71%到50.84%之间。这阻碍了细菌在初期到达并停留在物体表面。
3.5. OVH对细胞自聚集的影响
细菌的自聚集(auto-aggregation)是生物膜形成初期细胞相互黏附的关键步骤。OVH能有效抑制这一过程，胃蛋白酶源OVH在625-1250 μg/mL浓度下表现出42.01%-80.70%的自聚集抑制率，阻止了细菌微菌落的形成。
3.6. OVH对细胞敏感性和代谢的影响
纸片扩散法(disc diffusion assay)显示OVH具有抗菌活性，抑菌圈直径在6.38-9.88 mm之间。然而，MTT法检测生物膜代谢活性却未发现显著破坏，这可能与生物膜内部代谢异质性及存在低代谢状态的细胞有关。
3.7. 荧光显微镜成像
通过SYTO 9/PI活死细胞双染荧光显微镜观察发现，经胃蛋白酶源OVH处理的样品中，死细胞（红色荧光）与活细胞（绿色荧光）的比例最高，直观证实了其优异的抗生物膜和杀菌效果。
3.8. qRT-PCR测定生物膜相关基因的遗传表达
定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测了与运动(flgL, flaA)、群体感应(luxS, aphA)、黏附(mshA)等相关的生物膜形成基因的表达。结果与上述表型一致，胃蛋白酶源OVH处理组的这些基因表达水平最低，从分子层面解释了其抗生物膜机制。
3.9. 肽的表征与群体分析
肽组学分析在胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶源OVH中分别鉴定出2001、1189和106条肽段。利用PLS-DA模型成功根据酶源和抗生物膜活性区分了肽段群体，并筛选出对区分贡献最大的前15条特征肽，为后续活性肽的挖掘提供了明确目标。
3.10. 合成肽的体外抗菌和抗生物膜特性
从筛选出的肽段中，合成了两条新型肽PEPVL (PVLKDLLFKDSAIMLKRVPSLMDSQL)和PEASY (ASYGNAVCIFEPLGINSHKRNSQLKCQWLKTGQF)并进行验证。在250 μg/mL浓度下，PEPVL可抑制84.59%-91.36%的生物膜形成，并减少56.62%-64.18%的活菌数；PEASY可抑制28.62%-71.97%的生物膜形成，并减少29.98%-75.21%的活菌数，证实了它们具有显著的抗生物膜和抗菌双重功效。
研究结论与意义
本研究证实，卵转铁蛋白酶解物(OVH)是抗生物膜和抗菌活性肽的宝贵来源。通过多酶解策略结合系统的体外活性评价，发现胃蛋白酶源OVH在抑制副溶血性弧菌的运动、自聚集、EPS产生及生物膜形成方面综合表现最佳。研究最大的亮点在于，成功将肽组学技术与回归性机器学习方法PLS-DA相结合，从复杂的酶解肽混合物中高效、精准地 discriminative 出与抗生物膜活性最相关的肽段，并最终鉴定并体外验证了两种首次报道的新型抗生物膜肽PEPVL和PEASY。
这项研究具有多重重要意义。在理论上，它拓展了我们对卵转铁蛋白这一丰富资源生物活性的认知，特别是其对抗水产重要致病菌生物膜的潜力，并为理解抗生物膜肽的结构与功能关系提供了新的候选分子。在方法学上，建立了肽组学结合PLS-DA机器学习从复杂水解物中挖掘活性肽的研究范式，为未来从其他蛋白源中发现功能肽提供了可借鉴的技术路径。在应用层面，所发现的PEPVL和PEASY肽为开发新型、绿色、高效的生物膜控制剂提供了先导化合物，有望应用于海产品加工设备、包装材料或作为保鲜剂的组成部分，以应对副溶血性弧菌生物膜带来的挑战，对于提升海产品安全、减少因腐败和致病菌带来的经济损失具有潜在价值。
当然，研究也存在局限性与未来方向。例如，未考察亚抑制浓度(sub-MIC)下肽段对生物膜的影响，其确切的分子作用机制、构效关系以及与现有食品添加剂的对比和毒理学安全性评估仍需进一步深入探索。总体而言，这项研究为利用食品源性蛋白质开发对抗顽固性细菌生物膜的创新解决方案迈出了坚实的一步。
