《Nano Today》：DNA-templated
in situ self-assembly of metal-phenolic networks for plasmid delivery
编辑推荐：
DNA模板引导的金属-多酚自组装策略通过低毒Zn2?和生物相容性聚多酚实现有序纳米结构组装，有效解决传统质粒递送中的毒性、稳定性及转染效率问题，为基因治疗和生物技术提供新方法。
林藏|闫昭|潘梦婷|赵明珠|何莉|孙雪梅|孟庆瑶|王邦明|孔荣梅|孔卫恒|曲凤丽
山东省生命有机分析重点实验室，曲阜师范大学化学与化学工程学院，中国山东省曲阜市273165
摘要
基于DNA的矿化与自组装策略近来受到了广泛关注，然而大多数现有方法依赖于随机组装，忽视了DNA骨架的导向作用。在本研究中，我们利用质粒DNA（pDNA）作为结构支架，通过低毒性的Zn2+和生物相容性多酚来实现pDNA上的定向组装。对多种多酚配体的研究和比较分析表明，这种受控生长受到合理比例的控制，从而产生了不同的纳米结构形态。这些合理组装的平台解决了传统质粒递送方法在安全性、稳定性和表达效率方面长期存在的问题。该方法提升了金属-多酚网络在推进质粒递送技术方面的潜力，对基因治疗和生物技术应用具有重要意义。
引言
质粒是一种环状双链DNA分子，能够在宿主细胞内独立于染色体DNA进行复制，为外源基因提供稳定的遗传环境。[1]在基因工程中，质粒是不可或缺的基因载体，被用于克隆和扩增特定DNA序列，在基因克隆、表达、递送和调控研究中有着广泛的应用。[2]值得注意的是，质粒在基因治疗中也有多种应用。例如，在CAR-T、TCR-T、UCAR-T等细胞疗法以及腺相关病毒基因治疗中，质粒作为构建病毒载体和递送目标基因的基本材料。[3]在mRNA疫苗的生产中，质粒充当转录模板。[7]此外，在DNA疫苗制造中，质粒也是最终产品。[8],[9]因此，高效递送质粒对于这些应用至关重要，它直接影响基因表达效率以及生物技术产品的安全性和有效性。
尽管质粒具有诸多优势，但现有的递送策略仍存在诸多限制。例如，电穿孔、微注射和基因枪等物理方法需要复杂的设备，可能导致细胞损伤，从而扰乱细胞的正常生理状态。[10]生物方法（如病毒介导的转染）虽然转染效率高，但存在潜在的安全风险，包括病毒载体的致癌性和免疫原性。[11],[12]研究中常用的化学方法包括磷酸钙共沉淀和阳离子脂质体转染，[13],[14],[15]但这些方法存在不可避免的细胞毒性，并且通常会导致大量质粒在单一载体中聚集。由此产生的问题，如质粒缠结或复杂结构形成，会影响其在宿主细胞中的稳定性和正常表达。此外，在基因治疗应用中，通常需要将特定基因精确递送到特定类型的细胞中，[16]这对于大量质粒的递送来说是一个挑战。
合理的质粒封装策略对于提高递送的关键参数（如安全性、稳定性和表达效率）至关重要。近年来，基于DNA的矿化与自组装技术逐渐成为备受关注且发展迅速的方法。然而，大多数这些方法依赖于无序组装，未能充分利用DNA骨架的导向作用。受到传统金属有机配位化学的启发，[17],[18]新兴的金属-多酚网络（MPNs）引起了广泛关注，并为质粒递送策略提供了新的见解。[19],[20],[21]作为有机-无机杂化系统，MPNs结合了天然多酚的生物相容性和金属离子的配位活性。[22],[23]金属离子可以作为多酚分子之间的交联剂，使多酚和金属离子快速自组装成分子交联网络，形成纳米颗粒、[25]囊泡、[26]复合水凝胶或支架材料。[27]然而，金属离子和多酚的多样性和功能性变化，尤其是在涉及DNA的复杂三元系统中，给它们作为大分子核酸（如质粒）的载体带来了诸多挑战。这些挑战包括前体选择、复杂合成条件以及材料不稳定性的问题。
为了解决这些限制，本研究提出了一种创新的基于DNA（质粒）的原位自组装策略，用于构建MPN-pDNA复合物，如图1所示。通过使用低毒性的锌离子（Zn2+）和高生物相容性的多酚，该方法通过设计金属-多酚配位位点并精确控制其比例来实现质粒封装。这种固定封装质粒的方法显著减少了DNA链的无序聚集和缠结，从而提高了质粒的稳定性，降低了潜在的细胞损伤和毒性。此外，对酚类配体化学自组装机制的理论分析表明，Zn-polyphenol@pDNA（ZP@p）复合物的自组装过程是通过Zn与质粒碱基之间的非共价相互作用完成的。这种非共价相互作用有助于在组装和细胞内释放过程中保持质粒的结构完整性，从而促进其在宿主细胞中的有效释放，提高转染效率并实现精确的基因表达。这种新型质粒封装方法为质粒递送提供了一种更安全、更高效、更可控的方法，为DNA纳米技术和MPN化学的发展奠定了基础。
部分摘录
配体结构指导pDNA-金属-多酚的自组装
受到MPNs动态化学的启发，该设计利用了三个关键原理来实现高效的质粒递送：首先，pH依赖性的配位键的可逆性在生理pH下为pDNA提供了保护屏障，在酸性内体中迅速解体，从而及时释放 cargo；其次，受贻贝启发的多酚粘附机制确保了高封装效率；最后，可调的组装动力学实现了精确的形态工程。
结论
总结来说，我们提出了一种原位自组装策略，利用pDNA作为结构支架，结合低毒性的Zn2+和生物相容性多酚来形成有序的纳米结构。通过比较不同类型的多酚配体并系统分析它们的形态效应，我们证明了所得到的pDNA载体具有更高的稳定性、更好的遗传物质保护作用以及更高的转染效率。
CRediT作者贡献声明
林藏：撰写——原始草稿、可视化、数据整理、形式分析。闫昭：概念构思、监督、项目管理、资金获取、撰写——审稿与编辑。潘梦婷：实验研究。赵明珠：形式分析、资源准备。何莉：形式分析、资源准备。孙雪梅：形式分析、方法学设计。孟庆瑶：形式分析、方法学设计。王邦明：形式分析、方法学设计。孔荣梅：形式分析、方法学设计。孔卫恒：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2021YFA0910103）、国家自然科学基金（编号22274141、22207062、22304100、U25A20561）、浙江省科技创新计划（编号2022C03031、2023SDYXS0002）、山东省自然科学基金（编号ZR2022ZD28、ZR2022QB209、ZR2022QB223）、中国科学院杭州医学研究所基金（2024ZZBS08、2024ZZBS04）以及浙江省卫生厅的支持。
