《South African Journal of Botany》：An efficient method for producing tetraploid garlic through oryzalin immersion of shoots derived from embryogenic cultures
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本研究采用oryzalin处理印尼本地大蒜品种Lumbu Kuning的胚胎发生shoot clusters，优化浓度（25-50 μM）和时间（3天），成功诱导84%四倍体。四倍体表现为叶色深绿、气孔密度低、球茎形成增加，但生根和重量较低。该低细胞毒性方法为本地大蒜遗传改良提供了高效途径。
Ika Roostika | Tri Handayani | Fitrahtunnisa Fitrahtunnisa | Fajarudin Ahmad | Tri Handayani | Gungun Wiguna | Yati Supriati | Herlina Herlina | Siti Nur Asiyah Wardah | Fauz Fauziah | Erwin Al Hafiizh | Witjaksono
印度尼西亚国家研究与创新局（BRIN）农业与食品研究组织园艺研究中心，地址：Jl. Raya Bogor-Jakarta Km. 46, Cibinong, Bogor 16911
摘要
多倍体诱导是改良大蒜（Allium sativum L.）的一种有效策略，这种作物受到狭隘遗传多样性和较差适应性的限制。传统的秋水仙素处理方法通常需要高浓度和长时间暴露，这会降低存活率并产生不稳定的混合多倍体。在本研究中，我们使用oryzalin对印度尼西亚本地品种Lumbu Kuning进行多倍体诱导，处理材料来自胚胎发生培养物。外植体在25–200 μM的oryzalin中处理1、3或5天后，随后在再生培养基上培养，并每月进行两次继代培养，得到了多种非典型的芽形态。流式细胞术分析显示这种处理方法具有较高的诱导效率。最有效的处理方式是在25–50 μM的oryzalin中浸泡3天，多倍体诱导率可达84%。回归分析表明，随着处理时间的延长，敏感性增加，50%增殖剂量（PD??）从53.64 μM（1天）降至15.12 μM（5天）。四倍体在细胞学上保持稳定，而混合多倍体则经常分离为二倍体或四倍体品系。形态学特征显示，四倍体具有典型的巨型特征，包括较大的气孔、较低的气孔密度、更深的绿色叶片和更高的绿色色素含量。在发育方面，四倍体的小鳞茎形成能力增强，但生根能力减弱，小鳞茎重量低于二倍体，在第一代体外培养中未观察到明显的鳞茎增大。这些结果表明，胚胎发生芽簇结合优化的oryzalin处理方法能够高效且低细胞毒性地生成稳定的四倍体，为印度尼西亚本地大蒜的多倍体育种提供了有前景的途径。
引言
大蒜（Allium sativum L.）不仅是一种重要的粮食作物，还因其富含生物活性化合物而被视为药用植物。保护性代谢物如蒜氨酸（allicin生物合成的前体）、二烯丙基二硫化物和蒜氨酸赋予了其治疗特性，进一步强化了其作为功能性食品的健康益处（Yang等人，2021；Okoro等人，2023）。大蒜作为经济作物和药用资源的双重价值凸显了其在食品、制药和医疗保健行业中的重要性（Ansary等人，2020）。
大蒜据信起源于中亚，地中海盆地、南亚和中国是其次要的多样性中心（Dhall等人，2023）。近年来，中国主导了全球大蒜生产，供应量占全球总量的70%以上。其他国家，尤其是热带地区（如印度尼西亚），由于国内产量低，仍高度依赖进口。2019年，印度尼西亚的平均产量仅为7.23吨/公顷，远低于中国的27.94吨/公顷和全球平均水平（Dianawati等人，2022）。这种产量差距主要与不利的农业气候条件有关，因为印度尼西亚的热带低地限制了鳞茎的发育，而中国的温带地区则较为适宜。此外，印度尼西亚的种植依赖于狭窄的遗传基础、传统种植方式以及低质量的种球，而中国的生产得益于改良的品种、现代技术和大规模种植系统。印度尼西亚潮湿的环境中害虫和病害的高发进一步限制了产量，使得本地生产难以与市场上性能更好且价格更低的进口大蒜竞争（Yusuf等人，2025）。
大蒜的遗传改良受到生物学和技术因素的制约。大多数栽培的大蒜是不育的，几乎完全通过无性繁殖方式进行繁殖，这排除了使用传统育种方法（如杂交）的可能性（Aswani等人，2024；Dhall等人，2025）。特别是在印度尼西亚等热带地区，开花频率很低；即使发生抽薹，通常形成的是小鳞茎或地上块茎，从而限制了基于种子的改良机会（Azmi等人，2022）。因此，在大蒜中诱导开花仍然是一个重大挑战，无论是在热带还是亚热带条件下（Shemesh-Mayer等人，2013）。依赖无性繁殖进一步缩小了遗传基础，而使用体积大且易受病害侵袭的蒜瓣限制了改良种植材料的快速繁殖和传播。此外，大蒜庞大且高度杂合的基因组使得遗传分析和可遗传性状的鉴定变得复杂（Jia等人，2023）。随着繁殖周期的进行，病原体的累积进一步降低了植株的活力和产量稳定性。因此，大蒜的改良主要依赖于突变育种、组织培养、体细胞变异、多倍体化以及最近的分子和基因组方法，尽管进展速度比有性繁殖作物慢（Singh等人，2021；Shemesh-Mayer等人，2022）。
多倍体诱导已成为大蒜遗传改良的一种有前景的策略，特别是为了克服不育性和无性繁殖带来的限制（Wen等人，2022）。多倍体化通常赋予有利的农艺性状，包括器官增大、生物量增加、代谢活动增强以及对生物和非生物胁迫的耐受性提高（Lavania等人，2013；Salma等人，2017；Tossi等人，2022；Farhadi等人，2023）。例如，秋水仙素诱导的Asparagus officinale L.四倍体表现出显著更高的耐热性，表现为丙二醛（MDA）积累减少、抗氧化酶活性升高和脯氨酸含量增加，反映了细胞防御机制的增强（Chen等人，2020）。类似地，Moringa oleifera的诱导四倍体含有比二倍体更高的蛋白质、脂肪和钙含量，表明多倍体化可以改善作物的农艺表现和营养价值（Ridwan和Witjaksono，2020）。在Allium cepa中，四倍体植株表现出明显的形态变化，包括更高的幼苗高度和更大的鳞茎直径，以及比二倍体更高的抗氧化活性和可溶性糖含量（Abubakar等人，2025）。同样，Centella asiatica（L.）的四倍体表现出更大的叶片、更长的茎和更深的绿色，表明多倍体化在多种植物物种中的广泛应用性（Surson等人，2024）。
在大蒜中，多倍体化与形态和生化方面的改善相关。四倍体品系表现出更大的鳞茎尺寸、更厚的叶片以及稳定的矮化效应，同时有机硫化合物（如蒜氨酸、二烯丙基二硫化物和二烯丙基三硫化物）的积累增加（Wen等人，2022）。据报道，自四倍体大蒜植株的蒜氨酸浓度比二倍体高30.7%（Dixit和Chaudhary，2014），而诱导的四倍体还显示出二烯丙基二硫化物、烯丙基甲基三硫化物的显著增加，这些化合物是大蒜营养价值、药用价值和独特风味的基础（Yousef和Elsadek，2020）。除了代谢富集外，多倍体化还通过增强抗氧化能力和激素调节来提高多种作物的非生物胁迫耐受性（Islam等人，2022）。这些特性在印度尼西亚等热带环境中尤为重要，因为高温、高湿度和病害压力严重限制了产量稳定性。
多倍体化是一种有价值的途径，可以扩大大蒜的遗传多样性，并支持开发适应不同生长条件的改良品种。多倍体的化学诱导通常使用抗有丝分裂剂如秋水仙素、trifluralin和oryzalin来实现（Ebrahimzadeh等人，2018；Gantait和Mukherjee，2021），这些试剂通常应用于种子、分生组织或体外培养物，并在受控条件下进行。其中，oryzalin是一种二硝基苯胺类除草剂，由于其较强的植物微管结合亲和力、较低的细胞毒性和在较低浓度下的有效性，成为秋水仙素的有希望的替代品（Singh等人，2025；Yao等人，2025）。最近的研究表明，oryzalin在诱导多倍体方面比秋水仙素更有效，例如在Solanum commersonii ssp. malmeanum（Tomé等人，2016）和中国韭菜（Allium tuberosum Rottl. ex Spreng.）（Yao等人，2025）中的应用。在香蕉中，oryzalin处理成功从二倍体品种‘Pisang Rejang’和‘Mas Lumut’中生成了四倍体基因型（Poerba等人，2014，2017）。除了作为抗有丝分裂剂的功能外，oryzalin还被报道可以调节植物的次生代谢物合成，体现了其更广泛的生理影响（Madani等人，2021）。
本文描述了不同剂量和浸泡时间对印度尼西亚本地大蒜品种Lumbu Kuning体外芽的影响及其随后的生长和发育情况，特别是多倍体水平。我们的发现证明了使用经oryzalin处理的胚胎发生芽簇可以高效生产稳定的四倍体大蒜品系。所得四倍体表现出与多倍体一致的症状，包括较大的气孔、较低的气孔密度和更深的绿色叶片，并且在体外条件下比二倍体对照具有更高的小鳞茎形成能力。这项工作为未来旨在提高产量、质量和遗传多样性的大蒜改良计划提供了重要基础。
部分摘录
植物材料
本研究中使用的植物材料是通过印度尼西亚本地大蒜品种Lumbu Kuning的体外芽发生的体细胞胚胎形成的体外芽。体外芽根据印度尼西亚专利ID S000004563（Supriati等人，2022）、印度尼西亚专利P00202315074（Roostika等人，2023）和Fitrahtunnisa等人（2024）描述的方法进行诱导和增殖。胚胎发生愈伤组织在25 ± 2 °C的黑暗环境中培养。
诱导多倍体化及芽对外源物质oryzalin的化学敏感性研究
oryzalin浸泡处理显著影响了印度尼西亚大蒜品种Lumbu Kuning体外芽在培养及随后两次再生培养基继代培养后的生长和形态。芽的反应被分为典型、非典型或无生长（死亡）。典型的芽定义为从基盘正常生长出的直立结构，具有发育良好的圆柱形芽。叶片细长、线形且光滑，呈现均匀的浅至中等绿色
讨论
我们成功地使用体外自四倍体诱导方法，利用来自胚胎发生培养物的芽簇目标组织，高效生产出了本地大蒜品种“Lumbu Kuning”的四倍体基因型。芽簇在25–50 μM的oryzalin中浸泡3天后，然后在再生培养基上培养两个月，并进行两轮每月一次的继代培养，在此期间芽簇被分离而不需切除。
结论
研究表明，将芽簇浸泡在抗有丝分裂剂oryzalin中可成功诱导四倍体，因为在仅两次每月一次的继代培养后即可获得稳定的四倍体。从芽簇中容易分离出单个芽，表明芽的增殖可能是通过胚胎发生而非腋芽增殖实现的。在25–50 μM的oryzalin中浸泡3天是最有效的处理方式
作者贡献声明
Ika Roostika：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。Tri Handayani：初稿撰写、可视化处理、数据分析。Fitrahtunnisa Fitrahtunnisa：数据分析。Fajarudin Ahmad：初稿撰写、数据分析。Tri Handayani：审稿与编辑、方法学设计。Gungun Wiguna：初稿撰写、研究工作。Yati Supriati：利益声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了印度尼西亚教育基金会的RIIM Kompetisi资助，资助来自印度尼西亚财政部和印度尼西亚国家研究与创新局，依据决定书编号12/II.7/HK/2023和合同编号17/III.11/HK/2023，资助期限为2023年至2025年。我们感谢农业与食品研究组织、生命科学与环境研究组织以及农业协会的支持
