《Toxicon》：Oral co-exposure to
Clostridioides difficile toxin A and ovalbumin disrupts intestinal homeostasis and predisposes to food allergy in mice
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本研究通过构建OVA联合TcdA短期口服暴露模型和TcdA诱导的OVA口服致敏模型，探究TcdA在食物过敏敏化中的作用。结果表明，TcdA可破坏肠道屏障（ZO-1和occluding表达下降），改变肠道菌群多样性，并影响免疫应答（IL-4升高，IFN-γ和TGF-β降低），提示其可能通过干扰肠道稳态增强过敏原致敏。
徐晓倩|曾向|程友斗|杨平|高金燕|孟轩毅|吴勇|李欣|童萍|陈洪兵
中国南昌大学食品科学与资源国家重点实验室，南昌，330047
摘要
Clostridioides difficile的毒素A（TcdA）在我们之前的研究中被确定为食物过敏的口腔暴露风险因素，然而，其在致敏过程中的作用仍不清楚。为了全面研究TcdA（0.5 μg或4 μg）在过敏致敏中的潜在作用，本研究构建了两种小鼠模型：一种短期口服共同暴露OVA和TcdA的模型，以及一种由TcdA诱导的OVA-口服致敏模型。首先建立了口服共同暴露模型以评估TcdA对肠道稳态的影响。随着卵清蛋白（OVA）和4 μg TcdA的共同暴露，ZO-1和闭合蛋白的表达减少。同时，微生物群的β多样性下降，肠道免疫反应失调。此外，在致敏阶段应用TcdA后，典型的过敏指标（包括OVA特异性IgE和MCPT-1）保持不变。然而，IL-4水平升高，IFN-γ和TGF-β水平降低。这些结果表明，TcdA可能破坏肠道稳态，从而增加过敏原致敏的风险。
引言
由病原体和毒素引起的食品污染继续对全球公共卫生构成严重威胁（Lu等人，2020年）。在受污染的食品中最常见的病原体包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌（Gao等人，2024年）。最近关于Clostridioides difficile（C. difficile）在食品中存在的文献提出了一个新问题，即这种细菌是否会导致食品污染，而传统上认为它主要与医院接受抗生素治疗的患者有关（Borji等人，2023年；Hazarika等人，2023年；Rui等人，2024年）。C. difficile是一种革兰氏阳性且能产生孢子的细菌，在土壤和水中普遍存在（Popoff，2018年）。隐藏在土壤和水中的C. difficile可以通过多种途径进入不同种类的食品（Abay等人，2022年）。此外，C. difficile孢子对环境条件具有极强的抵抗力，能够在热处理和低温储存条件下存活（Rui等人，2024年）。例如，C. difficile孢子在牛肉中的活性并未因连续冷冻12周而受到影响（Malin等人，2016年）。由于这种细菌的高环境耐受性和多种传播途径，C. difficile及其孢子经常在各种日常食品中被检测到，尤其是在海鲜和禽肉中（Hazarika等人，2023年）。全球食品链中C. difficile的平均检出率为6.3%（Borji等人，2023年）。因此，食品中的C. difficile污染及其引发的公共卫生问题值得高度关注。
C. difficile的主要毒力因子Clostridioides difficile毒素A（TcdA）不仅会破坏肠道物理屏障，还会调节多种免疫反应。一方面，小鼠口服暴露于TcdA会导致肠道损伤（Lyerly等人，1985年）。此外，当TcdA暴露于人类结肠癌细胞T84时，紧密连接蛋白的表达减少，跨上皮电电阻和荧光素钠的通透性增加，这些都表明肠道屏障也受到了显著损害（Patrick Schenck等人，2013年）。在TcdA诱导的肠道屏障破坏机制中，P2Y6受体起着重要作用（Popoff等人，2013年）。另一方面，当TcdA的C末端区域的凝集素样结构与抗原一起口服给药时，结果显示TcdA片段可以增强针对抗原的免疫反应（Castagliuolo等人，2004年）。TcdA还被证明可以通过NF-κB和IKK途径促进树突状细胞（DCs）的成熟和趋化因子CXCL2的表达（Lee等人，2008年）。此外，TcdA还能激活人类肥大细胞（MCs）的脱颗粒作用（Meyer等人，2007年）。值得注意的是，受损的肠道屏障、DCs的成熟和MCs的脱颗粒作用也是食物过敏的关键反应（Liu等人，2025年；Renz等人，2018年）。
食物过敏是一个日益普遍的公共卫生问题，涉及遗传和环境因素（Deng等人，2023年）。那些隐藏在食品中的口腔暴露风险因素会随着食物自然进入肠道，并且最近逐渐受到关注（Xu等人，2024b）。考虑到C. difficile在日常食品中的频繁检出以及TcdA对食物过敏多种关键反应的调节作用，可以推断TcdA可能是一种口腔暴露风险因素。实际上，我们之前的研究已经发现，在卵清蛋白（OVA）诱导的食物过敏小鼠模型的挑战阶段口服暴露TcdA会加剧过敏反应（Xu等人，2025年）。值得注意的是，大多数食物过敏是IgE介导的反应，这些反应基于两个阶段：致敏阶段和挑战阶段（Ballegaard和B?gh，2023年）。为了全面了解TcdA对食物过敏的口腔暴露风险，也有必要关注TcdA对致敏阶段的影响。
因此，为了全面研究TcdA在过敏致敏中的潜在作用，首先通过建立短期口服共同暴露OVA和TcdA的模型来评估TcdA对肠道稳态的影响。随后构建了由TcdA诱导的OVA-口服致敏模型，并进一步研究了TcdA如何影响过敏原致敏。本研究旨在阐明TcdA对食物过敏原致敏的影响，同时提供关于口腔暴露风险因素、肠道稳态和食物过敏致敏之间相互作用的见解。
材料与试剂
TcdA购自List Biological Laboratories Inc（美国加利福尼亚州坎贝尔）。用于免疫组化的抗闭合蛋白（ZO）-1和抗闭合蛋白抗体由Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）提供。IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10和TGF-β的水平使用Thermo Fisher（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的商用未涂层ELISA试剂盒进行测定。山羊抗小鼠IgE-BIOT、山羊抗小鼠IgG(H + L)-HRP、山羊抗小鼠IgG1-BIOT和山羊抗小鼠IgG2a-HRP由Southern Biotech提供
短期口服共同暴露TcdA和OVA会破坏肠道物理屏障
小鼠口服共同暴露于TcdA和OVA七天后，使用HE和免疫荧光染色来评估肠道物理屏障的完整性。如图2A所示，对照组和OVA组之间的空肠形态没有显著差异。然而，添加TcdA后，空肠绒毛发生萎缩和破坏。OHT组的绒毛损伤最为严重。
同时，免疫荧光染色显示...
讨论
肠道屏障是抵御通过食物摄入的潜在有害物质的第一道防线（He等人，2022年）。它包括多种防御机制，如物理屏障、微生物屏障和免疫屏障（Mitamura等人，2021年）。这些多样的屏障以复杂的方式相互作用，以维持肠道稳态（Mitamura等人，2021年）。这种稳态的破坏在食物过敏的发病机制中起着关键作用，特别是通过过敏原的作用
结论
总之，为了全面研究TcdA在过敏致敏中的潜在作用，本研究分别构建了短期口服共同暴露OVA和TcdA的模型以及由TcdA诱导的OVA-口服致敏模型。通过这两种小鼠模型，证明了TcdA通过破坏物理屏障、微生物屏障和免疫屏障来破坏肠道稳态。此外，TcdA还具有增强食物过敏原致敏的潜力。这些发现再次表明...
伦理声明
动物实验方案遵循南昌大学机构动物护理和使用委员会的指导方针（伦理批准编号：NCULAE-20250218002）。同时，实验方案也符合ARRIVE指南的要求。
作者贡献声明
徐晓倩：概念构思、数据分析、调查、初稿撰写、审稿与编辑。曾向：概念构思、撰写、审稿与编辑。程友斗：概念构思、调查。杨平：数据管理、方法学。高金燕：资源提供、监督、撰写、审稿与编辑。孟轩毅：概念构思、撰写、审稿与编辑。吴勇：撰写、审稿与编辑。李欣：撰写、审稿与编辑。童萍：概念构思
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32272427）和南昌大学食品科学技术国家重点实验室研究计划（编号：SKLF-ZZA-202212）的支持。
