《Virology》：Optimization and evaluation of 3AB3 indirect ELISA for detection of foot-and-mouth disease virus nonstructural protein antibodies in sheep
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本研究针对印度绵羊口蹄疫血清监测需求，优化了基于重组3AB3蛋白的间接ELISA方法，并验证其性能。结果显示该方法敏感性达92.11%，特异性97.4%，显著优于商用PrioCHECK试剂盒，为绵羊大规模血清监测提供可靠工具。
作者：Manoranjan Rout、Laxmi Kant Pandey、Bikash Ranjan Prusty、Jajati Keshari Mohapatra、Rabindra Prasad Singh
印度布巴内斯瓦尔ICAR-国家口蹄疫研究所，邮编752050
摘要
背景
口蹄疫（FMD）是一种高度传染性的疾病，主要影响有蹄类动物，是全球小型反刍动物养殖业面临的主要威胁之一。在印度，这种疾病主要发生在与牛共同生活的羊群中。除非能够证明某种宿主物种在流行病学上无关紧要，并且有适当的诊断干预措施，否则需要采取多物种综合控制策略。由于羊对口蹄疫的症状较轻，因此往往无法获得明显的病变组织样本。因此，通过症状诊断和实验室检测病变组织来确认感染几乎是不可能的。在这种情况下，通过血清学方法检测特定于口蹄疫病毒的抗体（FMDV抗体）可以帮助追溯到曾经暴露于病毒的动物，无论是亚临床感染还是持续感染。
方法
为了检测动物是否曾经感染过FMDV，研究人员在印度牛群中应用了ELISA方法来检测非结构蛋白（NSP）3AB抗体。本研究将最初针对牛血清样本设计的重组3AB3蛋白间接ELISA方法扩展到了羊血清样本的检测中。在优化了间接ELISA参数后，还将其性能与国际认可的PrioCHECK FMDV NS试剂盒进行了比较。
结果
总体诊断灵敏度为92.11%，而在未感染和已接种疫苗的动物中的诊断特异性分别为97.4%和94.42%。
结论
在像印度这样羊群数量庞大且是羊肉和山羊肉最大出口国的国家，口蹄疫较为普遍，同时也有世界动物卫生组织（WOAH）认可的官方防控计划。这种经过优化的r3AB3间接ELISA方法可以大规模应用于羊群的口蹄疫血清监测。
引言
印度全国牲畜总数为5.3676亿头，其中羊的数量为7426万头，占总牲畜数量的13.83%（2019年全印度畜牧业普查报告，渔业、畜牧和乳业部，新德里）。印度在全球羊群数量中排名第二，占全球羊群总数的4.03%以上（FAOSTAT，2019年）。特伦甘纳邦、安得拉邦、卡纳塔克邦、拉贾斯坦邦、泰米尔纳德邦、查谟和克什米尔邦、马哈拉施特拉邦、古吉拉特邦、奥里萨邦和北方邦是羊群数量较多的地区。根据第20次畜牧业普查数据，特伦甘纳邦的羊群数量最多，约占25.72%，其次是安得拉邦（23.70%）和卡纳塔克邦（14.95%）。羊和山羊对印度小型农民、边缘农民以及无地劳动者的生计安全至关重要。由于羊容易感染口蹄疫，且它们通常与牛共同生活在混合养殖环境中，共享放牧场地并参与迁徙活动，因此隐性感染的羊可能会对口蹄疫防控工作造成重大挑战。据报道，口蹄疫给羊群带来的经济损失涉及多个方面，如死亡、羊毛产量下降、繁殖能力受损、体重减轻以及由继发病原体引起的并发症和治疗费用等。在印度，每头感染羊的平均经济损失约为2023印度卢比（Singh等人，2013年）。在政府支持的畜牧业健康与疾病控制计划（LHDCP）下，牛和水牛每年接种两次灭活的三价口蹄疫疫苗；然而，其他易感物种（如羊和山羊）尚未被纳入接种范围（Muthukrishnan等人，2020年）。
血清学检测作为口蹄疫诊断的关键手段，在进出口认证以及确认动物“无感染”方面具有重要意义（Brocchi等人，2006年）。在血清学平台上，检测口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSPs）的抗体被认为是病毒活性的重要指标，无论病毒血清型或疫苗接种状态如何（Barnett等人，2015年）。因此，NSP ELISA已被广泛用于无口蹄疫地区的感染检测以及流行地区的疾病监测（Clavijo等人，2004年；Rweyemamu等人，2008年）。据报道，3ABC多聚蛋白是检测FMDV感染的最可靠指标（Mackay等人，1998年）。目前大多数NSP抗体检测方法基于重组表达的抗原（Gelkop等人，2018年），使用大肠杆菌或昆虫细胞通过表达系统进行生产。通过Western blotting和免疫沉淀技术对蛋白质进行表征后，再开发间接ELISA方法来检测FMDV感染，并将其与疫苗接种状态区分开来。液相阻断ELISA（LPBE）在检测FMDV抗体方面具有优势，世界动物卫生组织（OIE/WOAH）推荐将其用于口蹄疫血清监测（Hamblin等人，1986a，1986b，2021年）。该检测方法也被证明在评估接种动物的保护性免疫力方面可靠且准确（Maradei等人，2008年）。
小型反刍动物在口蹄疫的流行病学和传播中起着重要作用，尤其是在混合养殖环境中，由于动物流动不受限制。针对少数易感物种的单独防控措施难以实施。由于羊对口蹄疫的易感性以及它们与牛共同生活、共享放牧场地和参与迁徙活动，隐性感染的羊可能会对防控工作构成挑战。口蹄疫给羊群带来的经济损失由多种因素造成，包括死亡、羊毛产量减少、繁殖能力下降、体重减轻以及继发病原体引起的并发症等。据估计，在印度情况下，每头感染羊的平均经济损失为2023印度卢比（Singh等人，2013年）。在印度，政府推动的畜牧业健康与疾病控制计划（LHDCP）中，牛和水牛每年接种两次灭活的三价口蹄疫疫苗；然而，其他易感物种（如羊和山羊）尚未被纳入接种范围（Muthukrishnan等人，2020年）。
血清学检测在口蹄疫诊断中至关重要，不仅在进出口认证中发挥作用，还能用于确认动物“无感染”状态（Brocchi等人，2006年）。在血清学平台上，检测FMDV非结构蛋白（NSPs）的抗体是判断病毒活性的关键指标，无论病毒血清型或疫苗接种状态如何（Barnett等人，2015年）。因此，NSP ELISA已在无口蹄疫地区广泛用于感染检测，在流行地区用于疾病监测（Clavijo等人，2004年；Rweyemamu等人，2008年）。3ABC多聚蛋白被认为是检测FMDV感染的最可靠指标（Mackay等人，1998年）。目前大多数NSP抗体检测方法基于重组表达的抗原，利用大肠杆菌或昆虫细胞通过表达系统生产抗原。通过Western blotting和免疫沉淀技术对蛋白质进行表征后，再开发间接ELISA方法来检测FMDV感染并区分疫苗接种与自然感染（DIVA）。液相阻断ELISA（LPBE）在检测FMDV抗体方面具有优势，世界动物卫生组织（OIE/WOAH）推荐将其用于口蹄疫血清监测（Hamblin等人，1986a，1986b，2021年）。该检测方法也被证明在评估接种动物的保护性免疫力方面可靠且准确（Maradei等人，2008年）。
小型反刍动物在口蹄疫的流行病学和传播中起着重要作用，尤其是在混合养殖环境中。由于动物流动不受限制，针对少数易感物种的防控措施难以实施。由于羊对口蹄疫的症状不明显，临床样本难以获取，因此通过血清学方法检测FMDV非结构蛋白（NSPs）抗体成为追溯病毒传播的唯一可行方法。印度已在全国范围内开展牛和水牛的疫苗接种工作，自2009年起采用世界动物卫生组织（WOAH）认可的重组3AB3间接ELISA方法对牛群进行监测（Mohapatra等人，2011年）。本研究进一步优化了该技术，并将其应用于羊群的口蹄疫血清监测。该检测方法的性能与商业NSP抗体检测ELISA试剂盒进行了比较和评估。随着口蹄疫防控工作的推进，使用优化后的检测方法对羊和山羊的哨点监测将变得越来越重要。
3AB3 NSP ELISA参数优化过程中收集的羊血清样本
为了优化检测方法，收集了来自不同流行病学背景的羊血清样本，包括未感染、已接种疫苗、临床感染以及表面健康的羊样本，并记录了相关病史。
在第一类样本中，主要收集了未感染羊的血清样本。为了优化和确定检测参数，从过去8年内未发生口蹄疫的地理隔离地区和正规养殖场收集了436份羊血清样本。
r3AB3蛋白的表达、纯化和免疫特性分析
His标签标记的r3AB3多聚蛋白在SDS-PAGE和Western blot检测中的分子量为约38 kDa，主要以可溶形式存在于上清液中。实际观察到的分子量（约38 kDa）与计算值（31 kDa，包括载体中的50个额外氨基酸残基）相比相差约7 kDa（Mohapatra等人，2011年）。通过在培养基中加入1 mM IPTG并在30°C下培养6小时可以最大程度地促进蛋白表达。
讨论
羊在印度农村社会的经济生活中发挥着重要作用。养羊业仍然是以游牧或落后方式为主的产业，主要涉及农村贫困人口和无地劳动者。由于大多数地区的放牧用地有限，牧民需要将羊群迁移到广阔的区域，甚至邻近省份。口蹄疫是一种急性且高度传染性的疾病...
结论
总之，这些结果证明了使用3AB3 NSP间接ELISA作为检测暴露于FMDV的羊的可靠且可行的工具。由于其高灵敏度和特异性，该免疫诊断方法具有在口蹄疫防控和根除计划中应用的潜力，能够有效检测感染羊。此外，这种NSP ELISA方法被证明是一种高效、简单、低成本且有效的FMDV NSP检测方法。
财务支持
本研究得到了印度农业研究委员会（ICAR）的新德里分部的资助。
作者贡献声明
Manoranjan Rout：概念设计、数据整理、正式分析、研究方法、验证、初稿撰写。Laxmi Kant Pandey：研究方法。Bikash Ranjan Prusty：研究方法。Jajati Keshari Mohapatra：研究方法、监督、审稿与编辑。Rabindra Prasad Singh：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究在ICAR的支持下完成。感谢FMD网络单位/区域中心的同事们在样本采集过程中提供的帮助。
