《Antioxidants》：Elucidating the Effects of Selenium Enrichment on the Structure and Antioxidant Properties of Selenium-Containing Proteins in Yeast Cells
Lixia He,
Xu Wang,
Jiangrong Xiao,
Jie Qiao,
Ying Ma and
Yi He
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本研究通过多光谱分析与自由基清除实验，系统揭示了硒（Se）在四种酵母（酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、戴尔有孢圆酵母）中富集后，对完整含硒蛋白结构（二级构象、表面疏水性）及其抗氧化功能（DPPH•、•OH、ABTS•+清除率）的协同调控机制。研究发现，硒代蛋氨酸（SeMet）的高效转化及其诱导的蛋白质结构松弛（β-折叠减少，无规则卷曲增加）是功能提升的关键驱动力，而非总硒含量。这为基于“结构-功能”范式的精准功能食品开发提供了新视角。
引言与研究背景
硒（Se）作为一种必需微量元素，在生物体的氧化还原稳态、免疫调节和疾病预防中扮演着不可替代的角色。成人每日推荐摄入量（RDA）通常为55-75微克。然而，天然食物中的硒含量高度依赖于土壤条件，导致摄入量不稳定和地域性缺乏风险。与无机硒相比，有机硒化合物（特别是硒代氨基酸）具有更高的生物利用度和更低的急性毒性，硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）分别是植物和动物组织中的主要形式。因此，将无机硒安全高效地转化为有机硒，是开发富硒产品、应对硒缺乏的关键路径。其中，微生物（特别是酵母）富集技术因其代谢活性强、培养成本低而成为新兴硒产业的核心技术。酵母能够将培养基中的无机硒（如亚硒酸盐）自主转化为硒蛋白、硒代氨基酸等有机形式，其生物结合硒在直接清除氧自由基、抑制脂质过氧化方面的效果显著优于无机硒化合物。然而，目前的研究存在一个关键空白：缺乏对硒掺入如何系统性改变不同酵母物种的完整蛋白质结构，以及这些构象变化是否直接决定了其抗氧化功效增强的系统性理解。本研究旨在填补这一空白。
材料与方法
本研究选取了四种具有代表性的酵母菌株：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 1575、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）CICC 1572、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）CICC 31189以及从湖北恩施关口葡萄中分离鉴定的戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）G-1。所有菌株均在添加了20 μg/mL亚硒酸钠的YPD液体培养基（富硒组）和标准无硒YPD培养基（对照组）中培养。培养结束后，收集酵母细胞，经冻干得到干酵母粉。通过超声破碎、冷丙酮沉淀、透析等方法提取总可溶性细胞内蛋白。采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定总硒和蛋白结合硒含量，并通过高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱（HPLC-ICP-MS/MS）分析硒形态。利用紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、荧光光谱、圆二色光谱（CD）以及ANS荧光探针法，系统表征了蛋白质的结构变化，包括二级结构组成和表面疏水性（H0）。通过DPPH•、ABTS•+和•OH自由基清除实验评估蛋白质的抗氧化活性。所有数据均进行统计学分析和皮尔逊相关性分析。
结果
3.1 菌株特异性的生物量响应与硒积累
在20 mg/L的硒（IV）压力下，所有菌株均表现出生长抑制，其中酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母的抑制较为显著，生物量分别减少了10.40%和27.70%。尽管如此，所有菌株都积累了大量的硒，总硒含量在1164.00 至 2858.70 μg/g干重之间。乳酸克鲁维酵母表现出卓越的积累能力（2858.70 μg/g，是对照组的737倍），而戴尔有孢圆酵母和马克斯克鲁维酵母的积累量相对较低。这种生物量减少与硒积累之间的反向关系暗示了内在的代谢权衡。
3.2 硒对蛋白产量及含硒蛋白形成的影响
硒富集对总蛋白产量的影响因菌株而异。在相同的硒处理下，富硒的酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母的蛋白产量相比各自对照组显著降低（9.69% 至 19.45%），这与硒诱导的蛋白毒性应激报道一致。相反，富硒的马克斯克鲁维酵母蛋白含量显著升高，这可能源于其代谢途径的重编程，增强了应激缓解蛋白的合成。关键的是，尽管对总蛋白产量的影响不同，硒富集普遍且极大地增强了硒向蛋白组分的掺入。蛋白结合硒浓度在富硒酵母中激增550至700倍，达到1000–5000 μg/g的水平。硒形态分析表明，在富硒酿酒酵母和富硒乳酸克鲁维酵母中，硒主要以硒代蛋氨酸（SeMet）形式存在，分别占可鉴定硒的85.80%和60.53%。而在富酸克鲁维酵母和富硒戴尔有孢圆酵母中，硒代胱氨酸（SeCys2）是主要形式。无机硒形态在所有样品中均保持低水平。
3.3 硒诱导的蛋白质结构改变
多技术分析表明，硒的掺入在保持蛋白质主链完整性的同时，诱导了菌株依赖性的结构扰动。
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紫外-可见光谱：在250 nm附近观察到一致性的蓝移，表明硒与肽键的C=O基团发生了相互作用。
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傅里叶变换红外光谱：在富硒酿酒酵母蛋白中，C-H和O-H的吸收峰发生红移，而在其他三种富硒酵母蛋白中，O-H吸收峰发生蓝移，表明硒的掺入改变了蛋白质的氢键特性。
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荧光光谱：富硒酿酒酵母和富硒乳酸克鲁维酵母蛋白的最大发射峰（约300 nm）发生轻微蓝移，表明色氨酸残基周围环境极性降低，疏水性增加。
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二级结构：圆二色谱分析显示，四种酵母蛋白的二级结构均以β-折叠为主。硒富集后，所有菌株的刚性β-折叠含量均显著减少。特别是在富硒酿酒酵母中，β-折叠从64.37%降至55.27%，同时无规则卷曲、β-转角、α-螺旋显著增加。其他菌株也表现出β-折叠减少和柔性结构（如无规则卷曲）增加的趋势，表明蛋白质构象从刚性核心向更灵活、更松弛的构象转变。
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表面疏水性：所有富硒酵母蛋白的表面疏水性均显著增加。其中，富硒酿酒酵母和富硒马克斯克鲁维酵母的增加幅度（分别为34.6%和48.7%）大于富硒乳酸克鲁维酵母和富硒戴尔有孢圆酵母（分别为10.8%和16.3%）。
3.4 含硒蛋白的抗氧化能力增强
与对照组相比，所有富硒酵母蛋白对DPPH•、ABTS•+和•OH三种自由基的清除率均有增强。其中，富硒酿酒酵母和富硒乳酸克鲁维酵母蛋白的抗氧化活性提升最为显著，而富硒马克斯克鲁维酵母和富硒戴尔有孢圆酵母蛋白的抗氧化活性（除富硒戴尔有孢圆酵母的DPPH•清除率外）提升不显著。
皮尔逊相关性分析揭示了结构变化、硒形态与功能增强之间的内在联系。Δβ-折叠的减少和Δ无规则卷曲的增加与ΔDPPH•清除能力的提升呈正相关。而硒代蛋氨酸（SeMet）的绝对含量与•OH清除能力的提升呈极强的正相关，与ΔABTS•+清除能力也呈显著正相关。
这些结果表明，功能的提升并非仅仅是总硒含量的副产品，而是由硒代蛋氨酸的靶向生物转化及其伴随的结构松弛所内在驱动的。富硒酿酒酵母能将吸收的硒高效转化为硒代蛋氨酸，并引发显著的蛋白质结构松弛（β-折叠减少，无规则卷曲增加）和表面疏水性增强，从而协同实现了最显著的抗氧化性能提升。相比之下，尽管乳酸克鲁维酵母总硒积累量最高，但其硒代蛋氨酸转化率相对较低，因此其抗氧化增强效果明显逊色于酿酒酵母。
3.5 技术挑战与商业化应用前景
本研究的发现为靶向选择和设计富硒酵母提供了科学依据。所建立的硒形态、蛋白质结构和抗氧化功能之间的相互关系，代表了从单纯追求总硒含量最大化，向更精细的精准设计策略的转变。例如，具有高硒代蛋氨酸含量和显著增强抗氧化能力的富硒酿酒酵母，是开发旨在缓解与氧化应激相关慢性疾病的抗氧化营养品的理想候选。然而，商业化仍面临挑战：在保持酵母活力的同时最大化生物转化效率是关键瓶颈；大规模发酵过程中维持结构一致性（即有益的、硒代蛋氨酸驱动的结构松弛）需要精细控制参数；从复杂的酵母基质中标准化提取总可溶性蛋白以确保批次间功能可重复性，也是一项重大工程挑战。未来的研究需转向体内动物模型和临床试验，以验证这些结构优化蛋白在复杂生物系统内的代谢吸收、生物利用度及特定健康益处。
结论
本研究为富硒酵母蛋白建立了一个关键的“结构-功能”范式，证明硒代蛋氨酸的掺入及其相关的结构重组，而非总硒的简单积累，是增强抗氧化功能的主要驱动力。研究结果挑战了传统的纯定量评估方法，揭示了特定的构象转变（如在酿酒酵母中观察到的深刻的硒代蛋氨酸驱动的结构松弛）对于最大化自由基清除能力至关重要。这强调了在评估元素生物转化的同时，必须评估蛋白质结构动力学的基本必要性。从工业角度来看，这些见解为菌株选择和工艺优化提供了新颖而精确的标准。通过优先选择那些能够将高生物转化效率与有益结构重塑相结合的酵母菌株，生产商可以超越传统的选择指标。这一“结构-功能”范式为靶向设计、质量控制和规模化生产下一代高效能富硒功能性食品和营养品奠定了坚实的科学基础。
