《Cells》：The Effect of Mechanical Loading on Mitophagy in Aged Myoblasts
Evangelos Tolis,
Eirini Chatzinikita,
Athanasios Moustogiannis,
Antonios Giannopoulos,
Maria Maridaki,
Michael Koutsilieris and
Anastassios Philippou
编辑推荐：
本文探究了周期性力学拉伸对衰老（senescent）C2C12成肌细胞中线粒体自噬（mitophagy）及肌生成（myogenesis）的调控作用。研究结果表明，特定的高应变机械负荷可上调衰老细胞中AMPK、p-ULK1、BNIP3L/NIX、Parkin和PGC-1α等关键蛋白的表达，从而激活线粒体自噬信号、启动线粒体自噬并促进线粒体生物合成（mitochondrial biogenesis），同时上调早期肌生成因子Myf5的表达。相反，相同的力学负荷在非衰老的对照细胞中则下调了这些通路。这提示力学刺激可特异性改善衰老肌细胞中线粒体质量控制和早期肌生成能力的衰退，为理解骨骼肌衰老（mitophaging）及探索相关干预策略提供了新的分子视角。
细胞生存与适应需要高能量产出，这主要由线粒体这一细胞器完成。线粒体能够响应细胞内外刺激改变其功能和形态。新的线粒体通过线粒体生物合成过程产生，而受损线粒体的选择性清除则通过称为线粒体自噬的自噬性降解实现。线粒体生物合成与线粒体自噬之间的相互作用和调控对于细胞适应环境与细胞内信号至关重要，例如骨骼肌细胞中的机械负荷和代谢压力。在骨骼肌中，从线粒体生物合成到自噬的各个步骤及其诱导的分子机制尚未完全阐明。此外，尽管有多种机制调控线粒体质量，但衰老似乎对线粒体生物合成和自噬之间的相互作用产生最不利的影响。衰老过程中蛋白质损伤的积累会损害骨骼肌线粒体功能。当衰老肌肉中积累多个受损或功能失调的线粒体时，线粒体自噬可能受损。衰老对骨骼肌线粒体自噬通路的影响研究尚不充分。有假设认为，衰老诱导的线粒体功能障碍和碎片化会导致线粒体自噬信号增强，以促进这些功能失调细胞器的清除。线粒体分裂和自噬的协调被认为受AMPK调控。早期研究也表明，AMPK介导的ULK-1磷酸化（Ser 555）促进线粒体自噬。当AMPK失活时，基础自噬可能发生，表明其他目前未知的通路可能调控线粒体自噬以响应各种刺激。此外，AMPK激活Parkin和Pink1以诱导自噬。尽管Pink1–Parkin通路可诱导自噬，但对于骨骼肌中AMPK介导的自噬激活并非必需。近来，AMPK已成为骨骼肌中重要的线粒体自噬调节因子，其激活可增强线粒体分裂，进而促进自噬体对受损线粒体的吞噬。在线粒体生物合成中，AMPK的激活似乎通过磷酸化PGC-1α起到促进作用。衰老过程中，PGC-1α在调控线粒体质量的信号通路串扰中起主要作用，并调节线粒体生物合成。此外，BNIP3L/NIX作为一种外膜蛋白，是线粒体自噬的受体，在受体介导的自噬中起关键作用，有助于维持肌肉健康。确实，肌肉细胞中该蛋白的缺失与衰老过程中炎症增加和线粒体功能损伤有关。而且，在缺乏Pink1/Parkin的情况下，BNIP3L/NIX似乎是肌细胞分化过程中线粒体清除的关键因子。线粒体自噬还通过肌生成和肌肉再生在修复/形成新肌细胞中发挥主要作用。肌生成由不同信号通路诱导，这些通路调控多种因子，特别是肌源性调节因子（MRF's），如Myf5和肌细胞生成素（myogenin），它们共同控制骨骼肌的生长和发育。有趣的是，线粒体自噬和肌生成是重要的肌肉细胞过程，很可能相互关联，并且都已显示在衰老过程中受损。利用体外模型模拟骨骼肌细胞衰老可极大地增进我们对衰老诱导改变的细胞和分子层面的认识。此外，机械负荷能够引起骨骼肌细胞的适应性变化，凸显了肌肉的可塑性及其改变质量和收缩表型的能力。虽然机械刺激已被证明可改善衰老肌肉中受损的肌生成，但它们对肌生成相关线粒体自噬以及与衰老相关的线粒体功能失调降解（mitophaging）的影响尚不清楚。因此，衰老肌细胞的体外机械负荷模型对于研究机械刺激在线粒体衰老中的作用尤为重要。
本研究旨在探讨体外机械拉伸对衰老成肌细胞线粒体自噬和肌生成潜能的影响。为此，研究使用C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系，通过多次细胞倍增模型复制细胞衰老。对照（年轻）细胞和衰老细胞在弹性膜上培养，并使用FX-5000应变装置进行被动循环拉伸，方案为15%伸长率、1Hz频率、持续12小时。通过蛋白质免疫印迹和实时定量PCR，评估了拉伸与未拉伸的对照及衰老成肌细胞细胞裂解物中线粒体自噬相关因子和肌源性调节因子的细胞信号和基因表达反应。
研究结果揭示了机械负荷对不同状态细胞中线粒体自噬信号、诱导、线粒体生物合成和肌生成调控的差异性影响。在线粒体自噬信号方面，研究发现，在对照成肌细胞中，拉伸方案导致磷酸化ULK1（p-ULK1）和AMPK蛋白表达相较于未拉伸细胞显著降低。而在衰老细胞中，相同的机械负荷方案诱导了此前未检测到的p-ULK1和AMPK的表达/激活。这表明机械负荷调节了参与线粒体自噬启动信号的关键调节因子，且这种影响对衰老细胞有益，对非衰老细胞不利。
在线粒体自噬诱导方面，通过检测线粒体自噬受体BNIP3L/NIX和Parkin的表达水平发现，拉伸导致对照细胞中BNIP3L/NIX和Parkin的表达显著下调。相反，在衰老成肌细胞中，机械负荷诱导了此前未检测到的BNIP3L/NIX受体表达，并上调了Parkin的表达。其中，BNIP3L/NIX的38 kDa条带对应其单体形式，76 kDa条带代表其二聚体形式，与功能激活和线粒体膜插入相关。Parkin在衰老未拉伸细胞中的表达接近检测阈值，负荷后的相对变化由于低基础水平而被放大。这进一步证实了所用负荷方案在衰老细胞中上调了这些对自噬激活至关重要的因子，而在对照细胞中则下调了相同蛋白的表达，表明其对衰老细胞和对照细胞的线粒体自噬相关通路产生了差异性影响。
在线粒体生物合成方面，研究检测了该过程关键因子PGC-1α的表达。结果显示，拉伸后对照细胞的PGC-1α表达相较于未拉伸细胞显著下降。与此相反，衰老细胞中该因子的表达相较于其未拉伸的对照组显著上调。这表明高应变负荷可诱导衰老肌细胞中的线粒体生物合成，同时抑制对照细胞中的该过程。
在肌源性调节因子方面，研究通过检测早期肌源性因子Myf5和晚期肌源性因子肌细胞生成素的mRNA表达来探讨细胞的肌生成潜能。结果显示，机械负荷后，对照细胞中Myf5的mRNA表达降低，而在衰老成肌细胞中则观察到相反的效果。相比之下，晚期肌源性分化因子肌细胞生成素在对照和衰老细胞中相较于未拉伸细胞均呈现mRNA表达下降。所有分析均在生长培养基中维持的增殖态成肌细胞中进行，未诱导分化。这表明所使用的负荷方案可能对衰老背景下的肌细胞分化产生积极影响，同时下调对照细胞中的该过程，而高应变方案可能会扰乱肌源性分化的完成，且与细胞是否衰老无关。
综上所述，本研究揭示了机械负荷在衰老和对照成肌细胞中对线粒体自噬和肌生成调控的复杂且差异性的影响。具体而言，高应变机械拉伸能够激活衰老细胞中AMPK/p-ULK1信号轴，诱导BNIP3L/NIX和Parkin表达，并促进PGC-1α介导的线粒体生物合成，从而可能改善衰老相关的线粒体自噬功能受损（mitophaging）并增强早期肌生成潜力。然而，相同的力学刺激在非衰老的对照细胞中却抑制了这些通路。这些发现表明，肌细胞对机械负荷的反应取决于其衰老状态，高应变负荷可能对衰老肌细胞产生“有益应激”，而对年轻肌细胞则可能构成“过度应激”。这为理解骨骼肌衰老的机制以及开发针对性的力学干预策略（如运动疗法）提供了重要的分子依据。研究也指出了当前局限，如主要通过信号和蛋白表达水平评估，而非直接测量自噬流或线粒体更新，未来需采用基于通量的检测和形态学方法进一步验证这些分子变化的功能性后果。
