葡萄酒生态系统作为益生菌潜在宝库：Lactiplantibacillus plantarum 与 Oenococcus oeni 分离株的体外比较评估

《Foods》：The Wine Ecosystem as a Reservoir for Potential Probiotics: A Comparative In Vitro Evaluation of Lactiplantibacillus plantarum and Oenococcus oeni Isolates Chong Yuan, Yuanyuan Liu, Gongchen He, Tongxin Xu, Ping Wang, Jingyue Liu, Shuwen Liu and Kan Shi

本研究通过多阶段筛选，从葡萄酒自发性发酵生态系统中，系统评估了乳酸菌的益生菌潜力。研究发现，L. plantarum 菌株 M-1 和 XJ14 在模拟胃肠环境中表现出均衡的耐受性与功能性，是理想的候选益生菌；而 L. plantarum 菌株 XJA2 虽不耐胃酸，但具有卓越的自聚集能力和肠道生存力，适合基于包埋的递送系统。该工作揭示了葡萄酒生态系统是发掘新型益生菌的宝贵资源。

　　

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   引言

益生菌（Probiotics）被定义为“当摄入足够数量时，能够对宿主健康产生有益作用的活的微生物”。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）是最受认可的益生菌类群之一，因其在调节肠道菌群、增强上皮屏障完整性和调节宿主免疫反应等方面的作用而备受重视。随着全球益生菌市场的增长，对非乳制品来源的新型益生菌的需求也在增加。葡萄酒生态系统是一个独特且具有多重选择压力的生态位，其低pH、高乙醇、二氧化硫、多酚和营养限制等条件，与人体胃肠道（Gastrointestinal Tract, GIT）所经历的恶劣环境具有相似性。在这种环境中存活的LAB，特别是 Lactiplantibacillus plantarum 和 Oenococcus oeni，可能具备应对胃肠道压力的先天耐受性，因此成为开发新型益生菌的潜在候选者。

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   材料与方法

本研究采用了来自中国葡萄酒苹果酸乳酸发酵（Malolactic Fermentation, MLF）过程的23株LAB分离株，包括12株 L. plantarum 和11株 O. oeni。筛选策略采用分阶段的“筛选漏斗”法，逐步排除耐受性差的菌株。

2.1. 初级筛选：单因素应激耐受性

首先评估了所有菌株对单因素应激的耐受性，包括酸胁迫（pH 3.2，5小时）、溶菌酶胁迫（100 mg/L，2小时）和胆汁盐胁迫（0.3%，2小时）。耐受性通过存活率（Survival Rate）评估，存活率低于25%的菌株在后续对应激测试中被排除。结果以热图形式呈现，显示出明显的种间和种内差异。所有 O. oeni 菌株均表现出极高的酸耐受性，但对溶菌酶极度敏感，因此全部被排除。L. plantarum 菌株则表现出显著的菌株间差异，其中菌株SY-5和XY-2因溶菌酶耐受性极低被排除，而菌株SY-6、M-7、M-8、M-9、XJ25和PC520则在后续的胆汁盐测试中因完全或几乎完全失活而被排除。

2.2. 次级筛选：模拟胃肠道耐受性

基于初级筛选结果，仅有四株 L. plantarum 菌株（M-1, SY-2, XJA2, XJ14）同时具备对酸、溶菌酶和胆汁盐的耐受性，被进一步用于模拟胃肠道耐受性测试。

模拟胃液（Simulated Gastric Juice, SGJ, pH 3.0，含胃蛋白酶）耐受性测试显示，菌株M-1和XJ14表现出优异的耐受性，存活率分别为91%和80%，而菌株SY-2和XJA2则表现出严重的胃敏感性，存活率仅为16%和2%。

模拟肠液（Simulated Intestinal Juice, SIJ, pH 8.0，含胰酶和猪胆提取物）耐受性测试显示，所有菌株的存活表现均有所改善。菌株XJA2、XJ14和M-1表现出强耐受性，存活率分别为120%、105%和85%，接近参考菌株ATCC 14917（96%）。菌株SY-2表现出中等耐受性（75%）。

2.3. 三级筛选：功能与安全性表征

对筛选出的四株 L. plantarum 菌株进行了功能与安全性表征。

自聚集（Auto-Aggregation）能力测定显示，所有菌株在24小时内自聚集率均超过40%的常用阈值。其中，菌株XJA2的自聚集能力最强（83.33%），显著高于参考菌株（66.33%）和其他菌株。菌株M-1的自聚集率也较高（77.76%）。

半乳寡糖（Galacto-Oligosaccharides, GOS）利用能力测试显示，当GOS作为唯一碳源时，所有菌株在4% GOS浓度下生长良好（OD₆₀₀> 2.0），表明它们具备代谢这种益生元的能力，其中菌株M-1、XJA2和XJ14表现出快速生长。

安全性评估包括溶血活性、生物胺（Biogenic Amine, BA）产生和抗生素敏感性测试。所有测试菌株均表现为γ-溶血（无溶血活性），生物胺产生检测为阴性，且对氯霉素、链霉素、青霉素和氨苄青霉素敏感。它们对万古霉素（Vancomycin）表现出的耐药性被确认为 Lactiplantibacillus 属固有的、非获得性的耐药，因此不构成生物安全危害。

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   结果与讨论

3.1. 菌株筛选与耐受性分析

研究揭示了显著的种间和种内耐受性差异。O. oeni 虽然酸耐受性强，但其对溶菌酶的极端敏感性构成了其作为口服益生菌的致命弱点，导致所有菌株在初级筛选中被淘汰。这凸显了在益生菌筛选早期纳入口腔阶段应激原（如溶菌酶）的必要性。在 L. plantarum 中，不同菌株对不同应激原的耐受性表现出不一致性，例如某些菌株耐酸但不耐胆汁盐，反之亦然。这强调了采用多阶段、多参数筛选策略的重要性，因为单一应激测试无法可靠预测菌株在复杂胃肠道环境中的整体存活力。

3.2. 功能与安全性特征

在功能表征中，菌株XJA2展现了最高的自聚集能力，这与其潜在的强大肠道粘附定植能力相关。所有菌株都能有效利用GOS，显示出良好的代谢适应性和潜在的合生元（Synbiotic）兼容性。全面的安全性评估确认了这些菌株符合益生菌候选株的基本生物安全标准，无溶血活性、不产生有害生物胺、且无可转移的获得性抗生素耐药基因。

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   结论

本研究表明，葡萄酒生态系统是筛选具有独特应激适应性和功能优势的新型益生菌候选株的宝贵资源。通过系统性筛选，鉴定出三株具有高潜力的 L. plantarum 菌株：

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  菌株M-1和XJ14在模拟胃肠环境中表现出均衡且强大的耐受性，同时具备良好的自聚集和GOS利用功能，适合直接用于益生菌制剂。
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  菌株XJA2虽然对模拟胃液敏感，但展现出卓越的肠道存活能力、最强的自聚集能力和高效的GOS代谢能力。其功能优势表明，它可能成为一种“功能特化型”菌株，通过微胶囊化（Microencapsulation）或食品基质缓冲等保护性递送策略，可以规避其胃酸敏感性，从而发挥其肠道定植和功能潜力。

综上所述，这项研究不仅验证了葡萄酒来源LAB的益生菌潜力，也展示了一种整合生存力、功能性和安全性的多阶段筛选框架，为从非传统环境中开发下一代益生菌提供了方法论参考和具体的候选资源。未来的研究应侧重于体内验证，以明确这些菌株的定植行为及其促进健康的具体功能。