气调包装与壳寡糖-EGCG复合物协同调控冷藏亚洲硬壳蛤肉的保鲜机理与品质维持研究

《Foods》：Combined Effects of Gas Composition in Modified Atmosphere Packaging and Chitooligosaccharide-EGCG on Quality Changes in Refrigerated Asian Hard Clam Meat Ajay Mittal, Claret Shalini D’souza, Mohammad Fikry, Matsapume Detcharoen, Soottawat Benjakul, Feby Luckose, Nurul Huda, Premy Puspitawati Rahayu and Avtar Singh

本篇研究探讨了气调包装（MAP）中不同气体组成（CO2/O2/N2），及壳寡糖-表没食子儿茶素没食子酸酯（CE）复合物的协同作用，对冷藏亚洲硬壳蛤肉品质与保质期的影响。研究发现，高CO2/低O2（特别是80% CO2/20% O2，即MAP4-CE组合）可有效抑制假单胞菌等腐败菌生长，延缓脂质氧化和挥发性盐基氮（TVB-N、TMA-N）的产生，将货架期显著延长至18天。CE复合物在抗氧化和抑制腐败方面提供了次要但有益的补充。该研究为利用天然防腐剂协同非热加工技术，延长贝类等易腐水产品的保鲜期提供了有效策略。

　　

4. 材料与方法

本研究旨在评估壳寡糖-表没食子儿茶素没食子酸酯（CE）复合物与不同气体组成（O₂/CO₂/N₂）的气调包装（MAP）相结合，对4℃冷藏条件下亚洲硬壳蛤肉品质的影响。实验中，新鲜的硬壳蛤购自泰国，经烫漂、去壳处理后，用浓度为600 ppm的CE复合物溶液均匀涂抹处理。蛤肉（100 g）置于聚苯乙烯托盘中，封装于PA/PE袋内，并以1:3（w/v）的样品气体比充入特定配比的混合气体，包括：40% CO₂/20% O₂/40% N₂（MAP1）、60% CO₂/10% O₂/30% N₂（MAP2）、80% CO₂/20% N₂（MAP3）和80% CO₂/20% O₂（MAP4）。同时，设置了未处理但进行相同MAP包装的对照组（MAP1-4）以及仅用CE处理但用空气包装的样品（CON-CE）和完全未处理的空气包装对照组（CON）。所有样品在4℃下储存18天，并每隔3天取样进行微生物、化学和物理指标的测定。

微生物学分析方面，测定了总需氧菌数（TVBC）、嗜冷菌数（PBC）、推测假单胞菌数（PPC）、弧菌、乳酸菌和产硫化氢细菌的数量。化学指标则包括衡量新鲜度的总挥发性盐基氮（TVB-N）和三甲胺氮（TMA-N）含量，以及评估脂质氧化的过氧化值（PV）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）含量。物理特性方面，监控了滴水损失、蒸煮损失以及质构特性（硬度和韧性）。此外，在储存期结束时（第18天），对微生物数量最低的样品（MAP4和MAP4-CE）以及对照组在货架期终点时的样品进行了脂肪酸谱分析和微生物群落16S rRNA测序。数据处理采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，并使用相关热图和主坐标分析（PCoA）等方法来评估各处理与指标间的关联及微生物群落结构的变化。

3. 结果与讨论

3.1. 硬壳蛤肉微生物数量的变化

不同处理对硬壳蛤肉微生物生长的影响显著。在为期18天的冷藏储存中，未处理的对照组（CON）的微生物数量增长最快，其总需氧菌数（TVBC）在第9天即超过了水产品可接受限值（6 log CFU/g）。而所有经过气调包装（MAP）和/或CE复合物处理的样品，其微生物数量均得到有效抑制。

具体来看，高浓度的CO₂显示出强大的抑菌效果。在MAP处理中，含有80% CO₂的组别（MAP4和MAP3）微生物数量始终低于CO₂浓度较低的组别。特别是含有20% O₂的MAP4处理，其抑制效果优于不含O₂的MAP3（80% CO₂/20% N₂），这表明在特定比例下，O₂的存在可能增强CO₂对腐败菌的抑制作用。CO₂的抑菌机制主要涉及其溶于组织液形成碳酸，降低细胞内pH值，干扰细菌细胞膜功能和酶活性。

CE复合物的添加进一步增强了防腐效果。虽然其独立作用（CON-CE）相比MAP较弱，但当CE与MAP联用时，显示出协同增效作用。例如，MAP1-CE组的TVBC显著低于单独的MAP1组。CE复合物因其抗菌和抗氧化活性，能够破坏细菌生物膜、损伤细胞壁，从而与MAP共同作用，更有效地延长货架期。

在具体菌群方面，未经处理的对照组中，假单胞菌、弧菌、乳酸菌和产硫化氢细菌的数量随储存时间显著增加。而在所有处理组中，这些特定腐败菌，尤其是弧菌和产硫化氢细菌，均未检出或保持在极低水平。综合表明，MAP与CE复合物的组合是控制冷藏蛤肉微生物腐败的有效策略。

3.2. 挥发性盐基氮（TVB-N）和三甲胺氮（TMA-N）含量的变化

TVB-N和TMA-N是评价水产品新鲜度和蛋白质分解程度的重要化学指标。在整个储存期间，对照组的TVB-N和TMA-N含量上升最快，表明其腐败进程加速。相比之下，所有处理组均显著延缓了这两种含氮化合物的积累。

处理效果与气体组成密切相关。高CO₂的MAP组（特别是MAP4和MAP3）以及含有CE复合物的处理组，其TVB-N和TMA-N含量始终维持在较低水平。这主要归因于CO₂和CE复合物对微生物生长的抑制，从而减少了微生物分解蛋白质产生胺类和氨等挥发性物质的过程。值得注意的是，即使在腐败后期，MAP对TVB-N和TMA-N生成的抑制能力似乎有限，但其对微生物总量的控制仍是延缓化学腐败的关键。

3.3. 过氧化值（PV）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）含量的变化

脂质氧化是影响水产品风味和营养品质的另一主要因素。PV反映了脂质初级氧化产物（氢过氧化物）的积累，而TBARS则代表了次级氧化产物（如丙二醛）的含量。

实验结果清晰显示，MAP处理和CE复合物都能有效抑制脂质氧化。对照组的PV和TBARS值在整个储存期内均最高。在MAP处理中，高CO₂组（MAP4）的氧化程度低于低CO₂组。一个有趣的发现是，含有20% O₂的MAP4组，其TBARS值反而低于不含O₂的MAP3组。这可能是因为O₂的缺失抑制了依赖氧的内源性抗氧化酶系统，导致促氧化因素积累，反而加剧了脂质氧化。此外，不同气体组成下微生物群落的差异也可能通过代谢影响氧化进程。

CE复合物因其酚羟基等活性基团，具有清除自由基的能力。在所有MAP处理中添加CE复合物，都进一步降低了PV和TBARS值。到储存第18天，MAP4-CE组的TBARS值仍低于通常认为会产生不良风味的阈值（2 mg MDA/kg），表明其脂质质量得到了良好保持。

3.4. 硬壳蛤肉物理特性的变化

气调包装对产品的持水性和质构产生了显著影响。与对照组相比，所有MAP处理组的滴水损失和蒸煮损失均显著更高，且这种损失随着储存时间延长而增加。这主要是由于高浓度CO₂溶解形成碳酸，导致肌肉pH轻微下降，引起肌原纤维蛋白变性，从而降低了其持水能力。CE复合物的添加进一步增加了滴水损失，可能是因为过量的酚类化合物在蛋白质表面形成包覆，降低了蛋白质的亲水性。

在质构方面，处理当天，所有处理组（CON-CE和MAP各组）的硬度和韧性均显著高于未处理的对照组。CE复合物中的EGCG可能促进了蛋白质交联，而MAP中的CO₂导致的蛋白变性也可能使肌肉纤维收缩，从而增加硬度。然而，在随后的冷藏储存过程中，所有样品的硬度和韧性都呈现下降趋势，其中对照组下降最为显著，这可能是由腐败菌释放的蛋白水解酶破坏肌肉组织结构所致。

3.5. 脂肪酸组成的变化

硬壳蛤肉富含多不饱和脂肪酸（PUFA），特别是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。分析显示，在储存结束时，所有样品的PUFA和单不饱和脂肪酸（MUFA）含量均有所下降，表明发生了脂质氧化。

对照组的PUFA含量下降幅度最大（26%），这与最高的PV和TBARS值相符。相比之下，MAP4和MAP4-CE处理组的PUFA保留率最高，分别仅下降了10%和8%。这证实了高CO₂MAP在抑制微生物生长、从而间接减缓脂质氧化方面的有效性，而CE复合物的添加提供了额外的抗氧化保护，共同维持了脂质的营养品质。

3.6. 不同气体组成与微生物/化学参数的相关性分析

为深入理解各因素的作用，研究进行了相关性热图分析。结果显示，CO₂浓度与过氧化值（PV）、TBARS含量以及假单胞菌生长速率呈强负相关。这意味着CO₂是抑制好氧腐败菌（如假单胞菌）和控制脂质氧化的主要决定因素。相反，O₂含量与这些氧化指标呈正相关。CE复合物变量与氧化指标仅呈弱负相关，表明其抗氧化作用虽有益，但次于气体组成的影响。此外，PV、TBARS和TMA-N之间高度正相关，说明脂质氧化和含氮腐败产物的形成是协同发生的。

3.7. 细菌多样性

通过16S rRNA测序分析微生物群落结构发现，MAP处理显著改变了蛤肉中的细菌群落构成，而非简单地降低物种丰富度（Alpha多样性）。

在门和科水平上，未经处理的对照组以变形菌纲（尤其是γ-变形菌纲）为主，这些是典型的水产品好氧腐败菌。而所有MAP处理组，无论是否添加CE复合物，其菌群都向更耐受CO₂的类群转变，如黄杆菌科、海藻杆菌科和支原体科。CE复合物的添加进一步抑制了弧菌等特定腐败菌的相对丰度。

Beta多样性分析（PCoA和NMDS）清楚地显示，对照组的微生物群落结构与所有MAP处理组（无论是否含CE）明显分离，聚集在 ordination 图的不同区域。这直观地证明了MAP是驱动微生物群落结构转变的主要因素。仅用CE处理的组（CON-CE）位于对照组和MAP组之间，说明CE单独使用也能影响菌群，但效果弱于MAP。

4. 结论

综上所述，本研究系统评估了气调包装与壳寡糖-EGCG复合物对冷藏亚洲硬壳蛤肉的联合保鲜效果。主要结论如下：在空气包装下，硬壳蛤肉的货架期约为9天；而使用CE复合物预处理并结合高CO₂气调包装（特别是80% CO₂/20% O₂，即MAP4-CE），可将微生物货架期显著延长至18天。该组合能有效抑制总需氧菌、假单胞菌等腐败菌的生长，延缓脂质氧化和挥发性盐基氮的生成，更好地保留多不饱和脂肪酸。高CO₂环境是抑制微生物和氧化的主导因素，而CE复合物提供了次要但有益的抗菌抗氧化辅助作用。然而，该技术会一定程度增加产品的滴水损失和蒸煮损失，并改变质构。微生物群落分析进一步证实，MAP将细菌群落转向了CO₂耐受型类群。该研究为利用天然防腐剂协同气调包装技术延长贝类等水产品货架期提供了理论依据和实践方案，未来可探索添加持水剂来改善其物理品质。