《International Journal of Molecular Sciences》：Anti-Inflammatory Potential of Novel Tethered Agonists of the Adhesion G Protein-Coupled Receptor F5
Artur Wnorowski,
Diana Pietrzak-Mitura,
Akanksha Mudgal,
Lorenzo Scrofani,
Magdalena Strachowska,
Piotr Draczkowski,
Krzysztof Jó?wiak,
Jakub Fichna and
Damian Jacenik
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本研究通过计算机模拟结合功能实验，鉴定出源自ADGRF5受体Stachel序列的新型高效多肽激动剂。关键氨基酸位点S11N和D13S的替换可使其效力提升高达6倍。体内实验证实，这些激动剂可显著改善小鼠实验性结肠炎的宏观损伤评分与结肠结构，揭示了ADGRF5作为一个治疗结肠炎的潜在新靶点，为开发基于Stachel序列的新型抗炎疗法提供了重要依据。
引言：ADGRF5与炎症性肠病
黏附G蛋白偶联受体F5(Adhesion G protein-coupled receptor F5, ADGRF5，曾用名GPR116)参与调控多种生理病理过程，如肺表面活性物质稳态、免疫反应、葡萄糖不耐受与胰岛素抵抗以及癌症进展。它属于黏附G蛋白偶联受体家族，具有一个包含多个结构域（如免疫球蛋白样重复序列和SEA结构域）的扩展N端胞外域。其C端跨膜区通过一个包含高度保守的GPCR蛋白水解位点(GPS)的自蛋白酶诱导(GAIN)结构域与N端区域连接。在GPS位点的自蛋白水解切割会产生一个被称为Stachel序列的栓系多肽激动剂，该序列位于GPS切割位点与第一个跨膜螺旋之间，作为受体的内源性激动剂。最近的研究表明，对应于Stachel序列的合成多肽可作为黏附GPCRs的外部激动剂，为调控ADGRF5活性提供了有前景的策略。已有研究证实，至少由9个氨基酸(aa)组成的Stachel核心序列是激活ADGRF5所必需的，而13-aa和12-aa的多肽版本被证明是最优激活长度。ADGRF5被激活后可调控Gαq/11等异源三聚体G蛋白，影响磷酸肌醇(IP)转换和钙离子(Ca2+)动员。这些信号事件不仅关乎细胞功能，ADGRF5依赖性信号传导还与多种人类疾病（包括癌症免疫）的进程相关。然而，ADGRF5在结肠炎（一种以免疫反应失调为特征的疾病）中的作用此前很大程度上被忽视了。本研究旨在设计并表征源自ADGRF5 Stachel序列的新型多肽激动剂，并评估其在临床前结肠炎模型中的治疗潜力。WT—purple), respectively.">
结果
1. Stachel肽C端区域对ADGRF5活性至关重要
为理解Stachel序列激活ADGRF5的机制，研究团队使用AlphaFold3(AF3)对受体与其栓系激动剂进行了结构建模。AF3模型以高置信度一致预测Stachel序列结合在由ADGRF5的TM1、TM2、TM3、TM5、TM6和TM7形成的口袋内。预测的结合机制利用了Stachel肽的两亲性。在受体口袋内，Stachel肽采用U形构象。其中央主要由苯丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸残基组成的疏水区域深深插入结合口袋。相比之下，核心Stachel肽两端和连接Stachel肽与TM1的连接区域则更靠近受体表面并大部分暴露于溶剂。这种空间排布与结合口袋的化学环境特征（内部主要为疏水性，入口处更具极性）一致。值得注意的是，栓系Stachel肽的C端区域（将其连接到ADGRF5的TM结构域）由于构象自由度有限，对相互作用贡献不大。为了进一步探究此C端区域的潜在作用，团队对ADGRF5与未结合肽PL01WT（残基991-1003，包含野生型Stachel序列）的相互作用进行了建模。该游离肽在其C端具有更大的构象自由度。AF3预测的复合物模型显示，外源性肽PL01WT取代了内源性栓系激动剂。在此构型中，PL01WTC端的Asp10和Ser8与受体形成了额外的氢键。肽C端的灵活性，伴随受体TM1和TM7的构象变化，促进了Stachel肽中Ser4与TM7上His1248之间形成氢键，同时使Pro12能够与TM1和TM7之间的疏水界面形成新的相互作用。这些观察表明，Stachel肽的C端区域有能力贡献于与ADGRF5的相互作用，其进一步优化可能增强结合亲和力。
2. 第11和13位点的修饰提升了Stachel衍生肽的功能效力
基于这些结构见解，研究团队接下来通过实验探究了优化内源性配体C端区域以增强其ADGRF5活性的潜力。他们使用了一个13-aa的多肽PL01WT（对应野生型ADGRF5 Stachel序列）作为代表性激动剂。如图所示，PL01WT能有效激活过表达ADGRF5的HEK-293细胞(HEK-ADGRF5)，以剂量依赖方式诱导快速的钙积累。研究还使用了对应ADGRF4 Stachel序列的13-aa肽作为阴性对照肽(NCP)，并证实其无法激活ADGRF5。具体而言，在高浓度(333 μM)和较低浓度(50 μM)的PL01WT下均观察到显著的钙内流，证明了该肽的激动剂潜力。最近的丙氨酸扫描诱变研究表明，Stachel序列中至少9个氨基酸是激活ADGRF5所必需的。此外，Stachel序列中的脯氨酸(Pro)残基被认为对栓系肽的活性特别重要。为验证该假设，团队分别将第9位或第12位的Pro残基替换为丙氨酸(Ala)，生成了PL01WT的变体PL02P9A和PL03P12A。如图所示，PL02P9A和PL03P12A均能诱导HEK-ADGRF5细胞的钙积累，但它们的效力与PL01WT相比显著降低，表明Pro9和Pro12都是Stachel衍生肽获得最佳活性所必需的。这与预测的Stachel-ADGRF5相互作用结构细节一致，其中Pro残基诱导了适配U形构象所必需的扭结；此外，Pro9被发现楔在TM5和TM7之间，限制了它们的移动性或诱导了特定构象。先前Bridges等人的研究确定第3、6和7位的Phe、Leu和Met残基是ADGRF5激动剂活性的关键残基。正如当前研究所建模的，这些残基与Ile5一起构成了Stachel序列中的疏水区域，在结合时被埋入受体的口袋中。因此，它们对于结合过程中有利的熵效应（将有序水分子从受体疏水口袋和肽的非极性残基周围重新分配到本体溶液中）至关重要。因此，团队避免修饰疏水核心区域，而将后续修饰重点放在Stachel衍生激动剂的C端尾部。具体而言，他们在第8、10、11或13位引入替换，分别用具有相似性质的氨基酸（如Thr或Cys，以及Glu或Asn）替换了天然的Ser和Asp残基。修饰第11位或第13位的肽（而非第8位或第10位）引发了显著增强的钙内流。这些数据表明，激动剂PL08S11T、PL09S11C、PL10D13E和PL11D13N与PL01WT相比，展现出改善的ADGRF5激活潜力。这与Brow等人的发现一致，他们指出第10位的Asp对于Stachel衍生激动剂与受体的相互作用至关重要，因为将肽截短至仅9个氨基酸会显著降低过表达ADGRF5细胞中的IP转换。总之，本研究的结果扩展了Brow等人的观察，证明第8位的Ser（而不仅仅是第9位和第12位的Pro，可能还有第10位的Asp）对于ADGRF5栓系激动剂的最佳活性很重要。综合来看，野生型和修饰型ADGRF5激动剂活性的比较分析表明，对第11位和13位的修饰可以增强Stachel衍生肽的功能效力。
3. 鉴定具有增强效力的新型ADGRF5激动剂
接下来，团队使用优化后的ADGRF5激动剂PL08S11T和PL10D13E验证了观察到的钙流特异性。结果显示，两者都能有效触发HEK-ADGRF5细胞的特异性钙内流，但在野生型HEK-293对照细胞中则不能。随后，团队进一步探索了对第11位和13位的修饰，生成了携带单点和双点氨基酸替换的多样化类似物面板。此外，还评估了截短肽PS26WT（代表天然ADGRF5 Stachel序列的12-aa片段）的活性。值得注意的是，如图所示，这些额外的修饰显著增强了激动剂反应。在固定浓度下筛选时，几种优化肽诱导的反应幅度（以钙流测量）比相同浓度下的PL01WT高出多达4倍。S11T peptide (A) and PL10D13Epeptide (B) in HEK-293 cells and HEK-293 cells with ADGRF5 overexpression was estimated by calcium flux. Activity of mature tethered ADGRF5 agonist (A) and peptides composed of 12 and 13 amino acids corresponding to Stachel sequence with modification in positions 11 and 13 (C) was estimated using calcium flux and compared to mature tethered ADGRF5 agonist. The value of EC50for PL01WT, PL08S11T, PL10D13E, PL22S11N,D13S, PL23S11T,D13S, PL24S11N,D13Hand PS31S11Npeptide estimated by calcium flux (D) and IP conversion (E) assays in ADGRF5 stably expressing HEK-293 cells. Activity of PS31S11Npeptide (F) in HEK-293 cells and HEK-293 cells with ADGRF5 overexpression was estimated by calcium flux. Data are expressed as mean ± SEM, n = 3 for independent experiments and n = 3–4 for technical replicates. * p < 0.05, p < 0.01,* p < 0.001 vs. P001.">
为建立剂量-反应关系并量化优化后激动剂的效力，团队接下来通过钙积累和磷酸肌醇(IP)转换实验，测定了一组Stachel衍生激动剂（即PL01WT、PL08S11T、PL10D13E、PL22S11N,D13S、PL23S11T,D13S、PL24S11N,D13H和PS31S11N）的半数有效浓度(EC50)值。如图所示，PL01WT、PL08S11T和PL10D13E激活ADGRF5的EC50值分别为59.4、56.4和49.7 μM。有趣的是，包含组合修饰的肽（PL22S11N,D13S、PL23S11T,D13S、PL24S11N,D13H）以及单点替换的截短类似物PS31S11N显示出显著更低的EC50值，分别为9.7、9.6、10.4和8.5 μM。这一趋势在IP积累实验中得到进一步证实，PL01WT激活ADGRF5的EC50值为219.5 μM，而PL24S11N,D13H和PS31S11N在低至70.4和43.4 μM的剂量下即可产生半最大激活。此外，研究证实PS26WT引发的Ca2+积累是由于ADGRF5激活，因为该效应在野生型HEK-293细胞中不存在，这加强了该截短的12-aa肽的受体特异性。总而言之，这些发现证明了成功开发出与亲本肽PL01WT相比效力增强高达6倍（通过EC50值的降低证明）的ADGRF5激动剂。
4. 具有修饰Stachel序列的ADGRF5激动剂触发细胞内信号转导
为探索新型ADGRF5激动剂诱导下游信号传导的能力，团队用PL01WT、PS26WT和PL19S11T,D13N孵育HEK-ADGRF5细胞。结果显示，PS26WT诱导了AKT和ERK1/2的时间依赖性磷酸化，但未影响真核延伸因子2(eEF2)的磷酸化。值得注意的是，与用PL01WT处理的细胞相比，用PL19S11T,D13N处理的HEK-ADGRF5细胞中观察到更高水平的磷酸化ERK1/2。此外，用PS26WT孵育HEK-ADGRF5细胞导致蛋白激酶A(PKA)底物发生明显的、时间依赖性的磷酸化，但对蛋白激酶C(PKC)或AMP激活蛋白激酶(AMPK)的底物影响甚微。总体而言，这一发现证明了具有修饰Stachel序列的ADGRF5激动剂与野生型13-aa肽相比，增强了细胞内信号传导。WT peptide on cellular signaling. The representative images and quantitative ratio obtained from Western blot analysis of non-activated and activated form of EF2, AKT, and ERK1/2 (A–D) in HEK-293 cells with ADGRF5 overexpression under PS26WTstimulation in relation PL01WTpeptide. The representative images (E) and quantitative ratio (F) obtained from Western blot analysis of non-activated and activated forms of ERK1/2 in HEK-293 cells with ADGRF5 overexpression under PL19S11T,D13Nstimulation in relation to PL01WTpeptide. The representative images (G–I) and quantitative ratio (J) obtained from Western blot analysis of phosphorylated PKA (G), PKC (H), and AMPK (I) substrates in HEK-293 cells with ADGRF5 overexpression under PS26WTstimulation. To note, the dotted line represents the level of PKA, PKC, and AMPK phosphorylation in untreated cells. Data are expressed as mean ± SEM; n = 3 for independent experiments and n = 3–4 for technical replicates.">
5. 具有修饰Stachel序列的ADGRF5激动剂预防结肠炎进展
越来越多的数据表明，ADGRF5在免疫反应中扮演重要角色，这一点主要在呼吸道中被强调。事实上，使用ADGRF5缺陷小鼠的研究表明，ADGRF5对表面活性剂稳态至关重要，其缺失与炎症相关。此外，大量证据强调了ADGRF5在癌症免疫背景下的功能。然而，ADGRF5在结肠炎中的作用仍知之甚少。基于现有证据，团队假设ADGRF5的激活可能抑制胃肠道的免疫反应。为探索新型AD
