《Journal of Oral Microbiology》：Shotgun metagenomic analysis of the tongue-coating microbiome reveals oral microbes and their functions in older adults with dementia
引言
痴呆症是一种以慢性进行性认知功能减退为特征的综合征，主要由神经系统退行性变引起。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）和帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是老年人群中最常见的神经退行性疾病。目前，此类疾病的明确诊断通常依赖脑组织尸检，而活体诊断则需结合多种生物标志物和临床特征进行综合分析，现有技术如脑脊液蛋白分析、功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, MRI）和正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）等往往具有侵入性、耗时且昂贵。因此，开发无创诊断工具，寻找与神经退行性疾病相关的生物标志物，成为当前研究的热点。
口腔微生物组被定义为口腔内所有微生物（包括细菌、古菌、真菌、原生动物和病毒）的集体基因组和基因产物，是人体内仅次于肠道的第二大微生物群落。口腔微生态失调可能通过神经系统、循环血液或血脑屏障进入大脑，从而影响健康。口腔作为生物样本（如细胞、唾液、微生物组、蛋白质、脂质和呼出气中的代谢物）的无创采集源，具有安全、易获取和非侵入性的显著优势。舌苔作为口腔微生物群的主要来源，由于其由舌上皮细胞和微生物形成的生物膜以稳定速率脱落，样本稳定性高，是研究口腔微生物动力学的有价值位点。
下一代测序（next-generation sequencing, NGS）技术，特别是鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），提供了对微生物结构和功能的高通量、高分辨率洞察，能够实现无偏见的全面功能分析。然而，尽管临床病理相关性研究取得了进展，但口腔微生物组在痴呆症等神经退行性疾病中的作用仍不清楚，针对老年人的研究尤为有限。本研究旨在通过鸟枪法宏基因组学分析痴呆症患者和健康老年人的口腔微生物组，探讨口腔微生物组作为痴呆症诊断和预防生物标志物的潜力。
材料与方法
本研究于2023年3月至2024年5月期间，从延世大学Severance医院神经内科和延世大学牙科医院高级全科牙科招募了58名65岁及以上的老年人，包括30名痴呆症患者和28名认知健康的个体。诊断由神经科医生使用韩国版简易精神状态检查量表第二版（Korean Mini-Mental State Examination 2nd edition, K-MMSE）、临床痴呆评定量表（Clinical Dementia Rating Scale, CDR）、首尔神经心理学筛查组合-II（Seoul Neuropsychological Screening Battery-II, SNSB）和脑部MRI进行。符合特定排除标准（如近期使用抗生素、存在长期口腔疾病、佩戴可摘义齿等）的个体被排除在外。样本量通过G*Power软件计算确定，以确保统计效力。
参与者被要求在舌苔样本采集前至少一小时禁食禁饮。使用无菌拭子和保存液从舌背均匀采集舌苔样本20秒。随后使用Soil Pro DNA提取试剂盒进行DNA提取。使用TruSeq Nano DNA高通量文库制备试剂盒（Illumina）构建测序文库，并在Illumina NovaSeq平台上进行测序（2×150 bp），每个样本生成约6 Gb数据，Q30分数>85%。
生物信息学与数据分析流程如下：使用Kneaddata（v0.10.0）和Trimmomatic（v0.39）去除接头序列和平均Phred分数低于20的读数，并利用Bowtie2（v2.4.5）去除比对到人类基因组（GRCh37）的读数。微生物物种谱使用MetaPhlAn4（v4.0.0）从预处理数据中生成。α多样性（香农指数和辛普森指数）从物种谱计算。β多样性通过Bray-Curtis距离进行评估，并使用R包vegan进行主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）。此外，还使用R包compositions对中心对数比（centered log-ratio, CLR）转换后的相对丰度进行了主成分分析（principal component analysis, PCA）。使用MaAsLin2识别痴呆症组和健康对照组之间的差异丰度物种和代谢通路，并调整了年龄、身体质量指数（body mass index, BMI）和性别等潜在混杂因素。代谢通路丰度谱使用人类微生物组计划统一代谢分析网络3（Human Microbiome Project Unified Metabolic Analysis Network 3, HUMAnN3）（v 3.5）基于MetaCyc通路数据库生成。所有统计分析均使用R（v4.4.1）进行，显著性水平设定为p < 0.05。
结果
痴呆症患者表现出独特的口腔微生物群组成
所有参与者的平均年龄为77.48岁。痴呆症组的平均年龄显著高于健康对照组（p = 0.0005）。痴呆症组的K-MMSE得分（19.23 ± 3.86）显著低于健康对照组（28.36 ± 1.22）（p < 0.0001）。两组间的α多样性（如香农指数）无显著差异，但基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，两组间的微生物组成存在显著差异。使用Aitchison距离对CLR转换后的相对丰度进行的PCA分析也得到一致结果。置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）进一步表明，痴呆状态是唯一与微生物谱显著相关的变量，而性别、BMI和年龄无显著关联。这些分析表明，痴呆状态与独特的口腔微生物组组成相关，且独立于年龄、性别和BMI。
2值的条形图，红色条形表示具有统计学显著影响的变量。">
与痴呆症相关的口腔细菌物种
从舌苔样本的微生物组中，共鉴定出15个门、52个纲、66个目、91个科、173个属和427个物种。在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是两组中的优势门。其中，变形菌门在健康对照组（中位数22.25%）中的丰度显著高于痴呆症组（中位数13.59%）（p = 0.0073）。在属水平上，链球菌属（Streptococcus）、罗氏菌属（Rothia）、普雷沃菌属（Prevotella）和奈瑟菌属（Neisseria）是优势属。奈瑟菌属在健康对照组中更丰富，而兰斯菲尔德菌属（Lancefieldella）在痴呆症组中更丰富。
在物种水平上，黏液罗氏菌（Rothia mucilaginosa）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、微黄奈瑟菌（Neisseria subflava）和副血链球菌（Streptococcus parasanguinis）是优势物种。微黄奈瑟菌在健康对照组（中位数15.43%）中的丰度显著高于痴呆症组（中位数7.19%）（p = 0.0021）。空肠弯曲杆菌（Prevotella jejuni）在痴呆症组（2.31%）中的丰度高于健康对照组（中位数0.95%）（p = 0.0082）。同样，婴儿链球菌（Streptococcus infantis）在健康对照组（1.78%）中的丰度高于痴呆症组（中位数1.20%）（p = 0.0490）。
为准确检测痴呆症组中富集的物种并考虑潜在混杂因素，使用MaAsLin2进行的差异丰度分析显示，小韦荣球菌（Veillonella parvula）（q = 0.0169）是痴呆症组中最显著富集的物种，其次是多栖异斯卡尔多维亚菌（Alloscardovia omnicolens）（q = 0.0432）。这些结果表明，V. parvula和A. omnicolens可能作为痴呆症的无创口腔宏基因组标志物。相比之下，牙劳特罗普菌（Lautropia dentalis）（q = 0.0169）是健康对照组中最显著富集的物种，其次是来自候选辐射门（Candidate Phyla Radiation, CPR）组中Candidatus Nanogingivalaceae科的一个未表征物种GGB12785_SGB19823（q = 0.0393）。这些与痴呆状态负相关的类群可能有助于更可靠的诊断。
与痴呆症相关的口腔细菌代谢通路
为了进一步探索与痴呆症相关的口腔细菌代谢功能，我们使用MaAsLin2进行了通路水平的差异丰度分析。在微生物代谢通路中，L-组氨酸降解III（PWY-5030）、L-组氨酸降解I（HISDEG-PWY）和生物素生物合成II（PWY-5005）在痴呆症组中相对于健康对照组更丰富。相反，泛醇-7生物合成通路（早期脱羧）（PWY-5855）在健康对照组中更丰富。
与痴呆症严重程度相关的口腔细菌物种
为了识别与痴呆症严重程度相关的微生物物种，我们使用评估定向、记忆和语言功能的K-MMSE评分进行了MaAsLin2回归分析。胸膜普雷沃菌（Prevotella pleuritidis）的丰度与K-MMSE评分呈正相关，丰度随评分升高而增加。同样，放线菌属口腔分类单元897（Actinomyces sp. oral taxon 897）、颊纤毛菌（Leptotrichia buccalis）和纤毛菌属口腔分类单元215（Leptotrichia sp. oral taxon 215）的丰度也随K-MMSE评分升高而显著增加。较高的K-MMSE评分表示痴呆症较轻，因此与K-MMSE评分正相关的口腔微生物物种可能与痴呆症患者相对较好的认知状态相关。相反，小口杆菌（Oribacterium parvum）的丰度与K-MMSE评分呈负相关，其相对丰度随K-MMSE评分升高而降低，表明其与较差的认知状态相关。
与痴呆症严重程度相关的口腔细菌代谢通路活动
使用类似的MaAsLin2回归分析，我们发现痴呆症患者中几种细菌代谢通路的丰度与K-MMSE评分呈负相关。这些通路包括岩藻糖降解（FUCCAT-PWY）、葡萄糖和木糖降解超级通路（superpathway of glucose and xylose degradation, PWY-6901）、L-抗坏血酸降解II（L-ascorbate degradation II, PWY-6961）和ppGpp代谢（ppGpp metabolism, PPGPPMET-PWY）。总的来说，这些发现表明，更严重的痴呆症与口腔微生物组中碳水化合物/能量代谢和应激反应通路的协同改变有关。
我们还发现了几种细菌代谢通路的丰度与K-MMSE评分呈正相关，包括γ-谷氨酰循环（gamma-glutamyl cycle, PWY-4041）、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺生物合成（L-glutamate and L-glutamine biosynthesis, PWY-5505）以及肌苷5′-磷酸生物合成I（inosine 5′-phosphate biosynthesis I, PWY-6123）和II（PWY-6124），其丰度随认知功能改善而增加。这些观察结果共同表明，由口腔共生菌编码的谷氨酰胺/谷氨酸相关代谢功能可能与痴呆症严重程度相关，并可能影响宿主神经生理。
讨论
本研究通过分析舌苔样本的鸟枪法宏基因组测序数据，比较了老年痴呆症患者与认知健康对照者的口腔微生物组。鸟枪法宏基因组测序比基于16S rRNA的分析提供了更高的分类学和功能分辨率。此外，舌苔样本具有相对稳定和易于采集的实用优势，使其成为疾病监测潜在有价值的无创生物标志物来源。
尽管在α多样性上没有统计学上的显著差异，但β多样性分析表明，痴呆症患者和健康对照者的整体微生物群组成存在明显分离。在这种群落水平的转变中，V. parvula和A. omnicolens在痴呆症组中显著富集，表明它们可能作为与痴呆症相关的关键口腔微生物标志物。值得注意的是，V. parvula通常被认为是临床健康口腔微生物群的组成部分，但有证据表明它也可能与神经炎症和神经退行性疾病（包括痴呆症）有关。从机制上讲，V. parvula的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）被认为可通过TLR4途径增加屏障通透性并激活巨噬细胞，从而促进促炎细胞因子释放和氧化应激，这些过程与神经退行性病理有关。类似地，A. omnicolens在卒中后认知障碍患者中的报道也支持了其参与认知衰退和神经退行过程的潜在可能性。
我们在推断的宏基因组功能潜力基础上，鉴定了与痴呆症相关的口腔细菌代谢通路。具体而言，与组氨酸降解和生物素生物合成通路相关的基因在痴呆症组中富集，而与泛醌/泛醇（辅酶Q）生物合成相关的基因在健康对照组中相对富集。组氨酸对神经功能很重要，并与抗氧化防御和氧化应激调节有关。微生物组氨酸降解相关基因在痴呆症中的富集，可能反映了与组氨酸可用性或利用紊乱相关的微生物组变化。相反，泛醌/泛醇是线粒体电子传递和氧化还原稳态的关键组成部分，这些过程在AD及相关痴呆症中经常被破坏。因此，痴呆相关微生物组中泛醌/泛醇生物合成基因的相对耗竭，可能与神经退行性变中更广泛的线粒体和氧化还原失调一致。
此外，我们发现几种细菌物种和代谢通路的丰度与痴呆症患者的痴呆症严重程度（以K-MMSE评分衡量）显著相关。由于较高的K-MMSE评分表示认知障碍较轻，因此与K-MMSE正相关的分类群或通路可能与相对保留的认知功能相关，而与K-MMSE负相关的分类群或通路则可能随着严重程度增加而追踪，并可能反映与认知衰退相关的过程。因此，与K-MMSE相关的口腔微生物特征可提供一个简单、无创的指标，用于预测痴呆症严重程度和认知状态。
在通路水平上，岩藻糖、葡萄糖和木糖降解，连同L-抗坏血酸降解和ppGpp代谢，与K-MMSE评分呈负相关，表明这些功能随着痴呆症严重程度的增加而相对富集。鉴于岩藻糖、葡萄糖和木糖降解构成了核心碳水化合物分解代谢途径，这些结果表明随着认知障碍恶化，宿主和饮食来源的糖的利用增加。L-抗坏血酸降解与K-MMSE的负相关进一步表明抗坏血酸处理改变，这与紊乱的氧化还原平衡和氧化应激反应一致。此外，ppGpp代谢表明细菌严谨反应和应激相关代谢重编程的激活。相反，γ-谷氨酰循环、谷氨酸/谷氨酰胺生物合成和肌苷5′-磷酸生物合成与K-MMSE评分呈正相关，将相对保留的认知与这些通路的富集联系起来。值得注意的是，与谷氨酰胺/谷氨酸代谢相关的通路是与K-MMSE评分相关的通路之一，突显了其与神经递质相关代谢功能的联系。与这一概念一致，肠道微生物GABA/谷氨酸比率升高已被提议作为轻度自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）的代谢标志物。类比之下，口腔微生物GABA/谷氨酸比率的不平衡可能与痴呆症严重程度相关；这一假说有待未来通过靶向代谢组学测量和纵向队列研究进行验证。
从机制上讲，谷氨酸是主要的兴奋性神经递质，并作为主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）的直接前体，而谷氨酰胺作为上游储备，通过谷氨酸-谷氨酰胺循环支持神经元-星形胶质细胞代谢耦合，该通路与大脑发育和神经退行性疾病有关。与微生物谷氨酸/谷氨酰胺代谢对神经退行性变的相关性一致，最近一项关于PD的大型队列研究报告了肠道宏基因组中参与谷氨酸合成的微生物基因的耗竭。
在口腔微生物组研究设计中，仔细考虑采样部位至关重要。为尽量减少牙周炎和龋病相关细菌的影响，本研究选择舌背作为采样部位，因为它受局部牙周或龋病病变的影响较小，这些病变通常与特定分类群（如牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和变形链球菌）更相关。研究表明，虽然通常与龋齿和牙周炎相关的分类群存在于舌微生物群中，但它们占少数（平均相对丰度<0.1%），并且不形成共生的共生群落。此外，由于舌上皮细胞和相关微生物的生物膜以中等速率脱落，舌苔微生物群表现出相对稳定性，使其成为微生物组研究的合适部位。
我们的研究存在一些局限性。首先，尽管采用了严格的参与者选择标准、严谨的元数据收集和宏基因组测序读数的质量控制以确保准确的疾病-微生物组关联，但混杂因素仍然存在。患者相关变量（如药物使用、免疫状态、饮食和口腔卫生）和技术因素（如采样方法、测序平台和生物信息学流程）可能影响口腔微生物组，导致研究间的不一致，并使识别可靠的微生物生物标志物复杂化。特别是，年龄是塑造人类口腔微生物组的一个已确定的混杂因素，痴呆症组和健康组之间存在显著差异，痴呆症患者年龄更大，这可能影响了观察到的关联。为减少错误发现，我们使用PERMANOVA分析和MaAsLin2调整了年龄、性别和BMI，结果显示痴呆状态是唯一与整体微生物组结构显著相关的变量。此外，由于样本量有限，我们无法全面调整其他潜在混杂因素（如社会经济状况、生活方式因素和健康相关变量）。其次，我们没有按痴呆亚型（如AD、PD或血管性痴呆）对参与者进行分层，这限制了我们检查亚型间潜在组成差异的能力，并可能在微生物组分析中引入了额外的异质性。
未来的研究应包括更大的参与者群体和更详细的协变量数据。此外，应采用标准化的方法和纵向设计，以阐明口腔微生物组与痴呆症进展之间因果关系的潜在机制。
结论
舌苔样本的鸟枪法宏基因组分析揭示了痴呆症患者与认知健康老年人在微生物组成和代谢功能上的显著差异。V. parvula在痴呆症组中显著富集，而L. dentalis在健康组中更丰富。在功能上，组氨酸降解和生物素生物合成通路在痴呆症患者中更丰富，而泛醇生物合成在健康个体中更丰富。此外，几种微生物类群和通路与K-MMSE评分显著相关，突显了它们作为与认知衰退相关的无创口腔生物标志物的潜力。
