《Journal of Oral Microbiology》：P. gingivalis induces endothelial dysfunction via mitochondrial fission dependent VDAC1-HK2 disassociation
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本文深入研究了牙周炎关键致病菌牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）如何通过诱发血管内皮细胞功能障碍，从而连接牙周病与心血管疾病。研究发现，P. gingivalis感染通过激活Drp1，促进其与线粒体外膜蛋白VDAC1的相互作用，导致VDAC1寡聚化，进而破坏VDAC1与HK2的正常结合，从而引起mPTP的过度开放。这一系列事件最终导致线粒体功能障碍（包括膜电位丧失、ROS增加、ATP减少等），并损害血管内皮依赖性舒张功能。该研究为理解牙周病与动脉粥样硬化之间的关联提供了新的分子机制见解，并提示Drp1-mPTP轴可能成为干预血管损伤的潜在治疗靶点。
背景
血管内皮在维持心血管稳态中起着核心作用，其功能障碍是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的关键早期事件。除传统危险因素外，慢性感染，特别是牙周炎相关病原体，正成为内皮功能障碍的潜在诱因。牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是牙周炎的关键致病菌，已被发现存在于动脉粥样硬化斑块中，并能粘附和侵入血管内皮细胞。尽管已有研究表明P. gingivalis可通过诱导氧化应激和炎症来损伤内皮功能，但其确切的分子机制仍未完全阐明。线粒体是细胞能量代谢和氧化还原调节的中心，其功能障碍可破坏内皮细胞功能。动力相关蛋白1（Drp1）是线粒体裂变的关键调节因子，也可通过与线粒体通透性转换孔（mPTP）的相互作用调节线粒体通透性。mPTP的异常开放与线粒体损伤和血管内皮功能障碍密切相关。mPTP的调控受线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和己糖激酶2（HK2）的影响，二者通过蛋白质-蛋白质相互作用稳定膜结构。本研究旨在通过体内外实验，探究P. gingivalis感染如何通过Drp1-mPTP轴影响线粒体完整性和内皮功能，并深入探讨VDAC1-HK2复合物是否在P. gingivalis诱导的Drp1依赖性mPTP开放中发挥机制性作用。
材料与方法
研究使用了人主动脉内皮细胞（HAECs）和C57BL/6小鼠模型。细胞感染P. gingivalis后，通过Drp1抑制剂Mdivi-1或mPTP抑制剂环孢素A（CsA）进行处理。采用蛋白质印迹、免疫荧光、免疫共沉淀等技术评估线粒体动力学和mPTP相关蛋白质相互作用。通过主动脉血管舒张和内皮完整性实验评估血管功能。VDAC1寡聚化通过交联实验进行评估。统计数据采用GraphPad Prism软件进行分析。
结果
P. gingivalis增强HAECs中Drp1磷酸化及其线粒体转位
显微CT显示口腔接种P. gingivalis诱导了牙周组织破坏。荧光原位杂交在主动脉组织中检测到P. gingivalis信号，表明细菌能与血管内皮直接相互作用。在HAECs中，P. gingivalis感染显著诱导了线粒体碎片化，平均线粒体长度减少了近38%。同时，Drp1在Ser616位点的磷酸化显著增加，并且线粒体中的p-Drp1（Ser616）增加，而细胞质中的减少，表明其发生了线粒体转位。免疫荧光也证实了p-Drp1（Ser616）与线粒体的共定位增强。Drp1抑制剂Mdivi-1处理或通过siRNA沉默Drp1基因，均可恢复正常的线粒体形态并阻止p-Drp1的线粒体转位。这些结果表明P. gingivalis诱导的线粒体裂变依赖于Drp1的激活。
Drp-1抑制缓解P. gingivalis诱导的线粒体和内皮功能障碍
在HAECs中，P. gingivalis感染显著降低了线粒体膜电位（JC-1红/绿荧光比率下降），使线粒体活性氧（mtROS）产生增加了7.8倍，并使ATP生成降低了27.5%。同时，TUNEL阳性细胞和凋亡细胞比例增加（几乎翻倍）。内皮细胞成管能力也显著受损，总管长减少了71.4%。重要的是，用Mdivi-1抑制Drp1可显著恢复线粒体功能并挽救内皮功能障碍。
Drp1介导的mPTP开放导致P. gingivalis诱导的线粒体和内皮功能障碍
P. gingivalis感染增加了mPTP的开放，表现为细胞色素C（CytC）从线粒体向细胞质转位以及钙黄绿素淬灭增加。这种效应可被Mdivi-1逆转，并且通过基因沉默Drp1也证实了其可减弱P. gingivalis诱导的mPTP过度开放，表明Drp1是这一过程的关键介质。此外，用CsA抑制mPTP可恢复线粒体膜电位、ATP生成和成管能力，同时将mtROS水平降低近50%，凋亡细胞比例降低约30%。这些结果表明，Drp1介导的mPTP开放在P. gingivalis诱导的线粒体和内皮功能障碍中起关键作用。
Drp1依赖性VDAC1寡聚化是P. gingivalis诱导线粒体功能障碍所必需的
免疫荧光显示，P. gingivalis感染的HAECs中VDAC1和p-Drp1的共定位增加，表明结合增强。免疫共沉淀证实了这种相互作用，并显示Mdivi-1处理可减弱该相互作用。此外，交联免疫印迹显示P. gingivalis增加了VDAC1寡聚体的形成。这种效应可被Drp1抑制所消除，同样也可被VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-4所抑制。这些发现表明P. gingivalis通过Drp1驱动VDAC1寡聚化。进一步研究发现，阻断VDAC1寡聚化可减轻P. gingivalis诱导的mPTP过度激活和mtROS生成，同时恢复内皮细胞成管能力，这表明P. gingivalis诱导的线粒体和内皮功能障碍是由VDAC1寡聚化介导的。
P. gingivalis促进HK2从VDAC1上解离
VDAC1-HK2相互作用对调节mPTP开放至关重要。计算模型确定了VDAC1和HK2之间的多个潜在结合位点。P. gingivalis感染后，VDAC1和HK2之间的共定位减少，表明HK2从VDAC1上解离。值得注意的是，通过药理学抑制Drp1（Mdivi-1）或VDAC1寡聚化（VBIT-4）以及基因沉默Drp1，可以恢复VDAC1-HK2结合，这一结果得到了免疫共沉淀的证实。与VDAC1在线粒体外膜的定位一致，亚细胞分级分离显示感染后HK2从线粒体向细胞质转移，表明线粒体HK2丢失。免疫荧光进一步证实了感染细胞中HK2-线粒体共定位减少，而Mdivi-1和VBIT-4可挽救此现象。这些数据共同表明，P. gingivalis可促进VDAC1寡聚化，从而破坏VDAC1-HK2复合物。
P. gingivalis通过Drp1介导的mPTP开放诱导小鼠内皮功能障碍
体内实验评估了P. gingivalis感染对内皮功能的影响。虽然HE染色未显示明显的结构剥脱，但免疫荧光分析显示CD31荧光强度显著降低，细胞凋亡和mtROS水平升高，表明氧化应激增强和内皮完整性受损。这与内皮层中p-Drp1（Ser616）表达增加以及VDAC1-HK2共定位破坏有关。重要的是，Mdivi-1或CsA处理有效地逆转了这些改变。在器官浴实验中，P. gingivalis显著损害了乙酰胆碱（ACh）诱导的内皮依赖性舒张，而CsA和Mdivi-1可恢复此功能，而硝普钠（SNP）诱导的内皮非依赖性舒张则不受影响。这些结果表明P. gingivalis通过Drp1介导的mPTP开放损害内皮依赖性血管舒张。本研究提出的分子假说如图所示：P. gingivalis感染后，HAECs中磷酸化Drp1表达上调，促进线粒体裂变。转位的p-Drp1与线粒体外膜上的VDAC1相互作用，促进VDAC1寡聚化并破坏VDAC1-HK2结合。这些事件导致mPTP过度开放，最终导致内皮功能障碍。
讨论
流行病学研究和临床试验的证据表明，牙周炎与血管功能障碍之间存在密切关联。P. gingivalis一旦进入血流，可侵入血管内皮细胞并损害其功能，从而将牙周感染与血管病理联系起来。本研究证明P. gingivalis感染通过Drp1-mPTP轴的异常激活引发显著的线粒体功能障碍和内皮损伤。从机制上讲，VDAC1-HK2复合物的解离是导致Drp1依赖性mPTP开放的关键上游事件。这些结果从机制上揭示了牙周病原体如何导致血管炎症和功能障碍，扩展了口腔感染与动脉粥样硬化之间的联系。
内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生和发展的关键早期事件，其特征是血管舒张受损、氧化应激和血管完整性丧失。在本研究中，口服接种P. gingivalis显著减弱了乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张，反映了NO生物利用度降低和内皮功能障碍的发生。这种血管损伤与明显的线粒体损伤密切相关，包括mtROS生成增加、线粒体膜电位丧失和结构碎片化。过量的线粒体ROS可直接干扰NO信号通路，从而减少NO合成和生物活性，同时促进能量耗竭并激活损害内皮屏障完整性的凋亡相关通路。这些线粒体改变共同解释了模型中观察到的血管舒张能力降低和内皮损伤加剧，为P. gingivalis诱导的血管功能障碍提供了机制基础。此外，在感染小鼠的主动脉中检测到P. gingivalis，表明直接的微生物损伤可能导致内皮损伤。
Drp1是一种GTP酶，介导线粒体裂变并调节线粒体形态、生物能量和质量控制。Drp1的过度激活会导致过度裂变、线粒体去极化和mtROS积累，这些事件与内皮功能障碍和动脉粥样硬化有关。先前的体外研究表明，P. gingivalis在内皮细胞中诱导了Drp1依赖性线粒体裂变，导致线粒体功能障碍和随后的内皮功能受损。本研究扩展了先前的发现，证明抑制Drp1可减轻P. gingivalis诱导的小鼠内皮依赖性血管舒张障碍。在此过程中，使用Mdivi-1抑制Drp1活性，该抑制剂并非降低蛋白质丰度，而是限制Drp1的GTP酶活性和自组装，从而提供了一种选择性抑制Drp1激活的药理学手段。
与本研究结果一致，先前的研究表明，P. gingivalis感染后，Drp1激活伴随着mPTP开放和线粒体膜电位丧失。然而，这些研究并未阐明Drp1是直接介导mPTP开放，还是作为影响该过程的调节因子间接起作用。在线粒体裂变过程中，活化的Drp1从细胞质募集到线粒体外膜，在那里形成寡聚环从而收缩线粒体。VDAC1是外膜上的一种成孔蛋白，可以作为停靠或协调位点之一，帮助将Drp1定位在裂变位点。重要的是，本研究发现Drp-1直接与VDAC相互作用，促进其寡聚化，这种结构重排损害了其与HK2的结合。HK2传统上被认为是催化葡萄糖磷酸化的关键糖酵解酶。然而，新出现的证据表明，其与线粒体外膜的结合在调节mPTP开放中起关键作用。在生理条件下，HK2-VDAC1复合物通过防止过度的离子跨膜流动来维持线粒体膜电位并限制通透性转换。一旦Drp1诱导的VDAC1寡聚化破坏该复合物，HK2就会从线粒体上解离，导致mPTP开放、线粒体去极化和CytC释放。
有趣的是，另一种己糖激酶亚型HK1也与P. gingivalis相关的发病机制有关。研究表明，P. gingivalis脂多糖（LPS）增强了巨噬细胞中Drp1和HK1之间的相互作用，从而促进mPTP过度开放。这一观察结果与本研究的发现非常吻合，进一步支持了P. gingivalis可能通过多种机制调节Drp1-mPTP轴以驱动异常的线粒体通透性转换的观点。然而，基于目前的发现，HK2解离仅是反映了mPTP的去抑制，还是也主动促成了下游的线粒体功能障碍，仍有待确定。未来的研究有必要探索HK2解离在调节内皮线粒体稳态中的潜在双重作用。
本研究存在一些局限性。首先，虽然我们在主动脉中检测到P. gingivalis，但其从溃疡的牙周上皮逃逸并到达远处血管组织的途径尚不清楚。目前的证据表明，牙周细菌可能通过“搭便车”的方式在循环宿主细胞（包括单核细胞、红细胞和树突状细胞）内传播。这些细胞可以内化活的细菌，随后将其递送至远端血管内皮，为口腔生态位以外的内皮定植提供了合理的机制。需要指出的是，FISH检测到的是P. gingivalis的rRNA信号，而非活的细菌，这些信号可能部分来源于P. gingivalis释放的外膜囊泡。因此，验证细菌活力需要额外的方法，如基于培养的测定。本研究的另一个局限性是未调查导致P. gingivalis诱导内皮功能障碍的特定毒力因子。P. gingivalis表达多种毒力因子，包括称为牙龈蛋白的赖氨酸和精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。值得注意的是，Farrugia等人表明P. gingivalis通过牙龈蛋白酶依赖性机制破坏内皮稳态。未来的研究需要确定这些因子是否以及如何直接靶向Drp1以诱导线粒体和内皮功能障碍。此外，虽然我们使用Mdivi-1抑制了Drp1活性，但需要遗传学方法来排除潜在的脱靶效应。使用内皮特异性Drp1敲除小鼠将进一步阐明Drp1在P. gingivalis诱导的内皮功能障碍中的体内作用。
尽管存在某些局限性，但本研究提示Drp1通过驱动VDAC1寡聚化和HK2解离，作为线粒体通透性的上游调节因子。这一机制将Drp1介导的线粒体裂变与mPTP开放联系起来，并为P. gingivalis感染如何通过Drp1–VDAC1–HK2轴诱导线粒体功能障碍和内皮损伤提供了合理的解释。
结论
本研究证明，P. gingivalis通过Drp1介导的mPTP开放，破坏VDAC1-HK2复合物，从而诱导内皮功能障碍。这些发现增进了对牙周感染与动脉粥样硬化之间临床观察到的联系的理解。
