《mAbs》：Using mass spectrometry for robust identity release testing in a global quality control network
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本文综述了罗氏/基因泰克开发并建立的基于质谱的平台化身份(ID)检测方法，用于生物制剂在全球临床和商业化质控环境中的常规放行检测。该方法结合肽图分析与液相色谱-质谱(LC-MS)技术，实现了数据自动评估，具有用户友好、高稳健性、可降低验证工作量与错误率等优势，并能对氨基酸修饰进行灵敏的高分辨率评估，所获数据可进一步用于生产过程偏差管理与质量评估。
引言
在生物制药行业，产品质量控制(Quality Control, QC)是确保药物安全性和有效性的基石。其中，产品身份(Identity, ID)检测是质控中一项基本且强制性的要求，旨在确认所生产的产品与预期目标一致。罗氏(Roche)和基因泰ch(Genentech)在技术产品开发中，常规使用基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)等技术，对抗体类药物和其他蛋白质进行详细的表征和结构分析。例如，ESI-MS可直接用于完整分子的分析，或与液相色谱(LC-ESI-MS)联用，以验证目标蛋白的一级结构，并评估其分子完整性（如聚集和片段化）以及化学和翻译后氨基酸修饰，如N-糖基化(N-glycosylation)、氧化(Oxidation)、脱酰胺(Deamidation)、异构化(Isomerization)和糖化(Glycation)。在非GMP管制的研发环境中，质谱技术已被广泛用于支持工艺可比性、配方开发等研究。然而，在受法规约束的GMP质控环境中，将质谱技术用于产品放行和稳定性测试，其可行性与优势一直备受探讨。核心问题在于，对于复杂的蛋白质药物，从传统的电泳和色谱方法转向基于质谱的多属性监测(Multi-Attribute Monitoring, MAM)方法是否利大于弊，以及如何在GMP质控环境中有效实施这些技术。主要的挑战在于建立定量的产品放行标准、稳定性标准以及适用于确定产品电荷和大小变异的系统适用性标准。传统的身份检测结果通常报告为“身份符合”，其验证工作侧重于方法的稳健性(Robustness)和特异性(Specificity)，而对精密度(Precision)、线性(Linearity)等定量方面的评估并非强制要求。因此，采用高分辨率的质谱法替代其他生化或生物物理方法，代表了产品放行控制策略的一种现代化革新。除了效价测定，其他创新技术如侧向流免疫层析(Lateral Flow Immunoassay)和拉曼光谱(Raman Spectroscopy)也在评估之中。
罗氏/基因泰ch向基于质谱的身份检测方法的过渡，是过去几十年技术和策略逐步演变的结果。十多年前，由于抗体产品管线迅速扩展，原有的特异性有限的方法（如毛细管区带电泳）被更高分辨率的、基于肽图分析的方法所取代。为了在全球QC网络中简化部署，最初为后期临床和商业产品使用了基于LC-UV检测的平台化肽图分析方法，并选择Lys-C酶作为蛋白酶以简化肽谱。与此同时，也为早期临床项目开发了基于质谱的方法。由于在商业化环境中LC-UV-Lys-C肽图分析的良好经验，以及在临床领域应用质谱的经验，罗氏/基因泰ch近期决定将质谱法也用于治疗性蛋白质商业产品的身份放行检测。
方法开发与验证
最初，罗氏/基因泰ch对后期临床和商业产品采用基于Lys-C酶切结合LC-UV检测的平台化肽图分析法进行身份放行检测。该方法基于参考标准品(Reference Standard, RS)与放行样品色谱图的肉眼比对，要求产品特异性肽段（即ID标志物）在两者的色谱图中都能被清晰识别。尽管该方法已成功验证并使用了多年，但其存在一些性能问题，使得维护工作繁重。所得UV色谱图通常很复杂，且因使用不同的分析条件（如不同色谱柱批次或HPLC系统）而表现出显著的变异性，如保留时间漂移和分辨率差异。此外，对复杂肽谱的解释需要分析人员经过充分培训并拥有丰富经验，但仍可能存在主观判断。监管机构也常对此视觉比对方法提出疑问，并要求引入额外的定量参数，如保留时间窗口或特定强度阈值。另一个缺点是，每次推出新产品都必须重新确定ID标志物，因为需要在验证中重新确认其对整个产品组合的特异性。因此，在2021年，罗氏/基因泰ch的QC网络决定停止使用视觉LC-UV方法，转而采用LC-MS检测系统。
经过全面评估，最终选择了配备单四极杆质量检测器的沃特世(Waters) ACQUITY QDa系统。该系统在身份检测和定量MAM应用中的适用性已在独立研究中得到证实。新的检测策略旨在开发一种不依赖视觉比对，而是通过精确测定Lys-C产物肽的质量，并利用肽段数据库进行自动数据评估的身份检测方法。因此，首先基于实验数据，为所有相关的临床和商业蛋白产品建立了Lys-C肽段数据库。首先，通过生物信息学方法对目标蛋白进行Lys-C虚拟酶切，并与整体产品组合（目前包含120种生物制剂的序列）进行比较，以确定产品特异性肽的质量。随后，通过实验数据评估这些理论确定的肽段是否能在QDa系统中被足够强度的检测到。通过高分辨LC-MS系统对检测到的肽质量进行测序，以确认所选肽段的身份。接着，验证所选Lys-C肽段的特异性，确保它们是真正的产品特异性肽，在其他产品数据集中检测不到。目前，至少需要2个产品特异性肽段（ID峰）才能继续进行方法开发。
检测策略与实验设置
方法的设置和执行流程包括蛋白质酶切和随后的LC-MS分析。为了实现简单、自动化的数据评估，从记录的3D质谱图（基于强度、保留时间和m/z值）中，针对产品特异性ID峰，利用其特定的m/z值生成提取离子色谱图(Extracted Ion Chromatogram, XIC)。每个ID肽的XIC是一个2D色谱图（在预期m/z值下的强度与保留时间）。对选定ID峰的所得质谱图，通过预先设定的评估标准进行进一步处理，这些标准是在方法开发初期建立的。评估标准包括保留时间、最小积分阈值、最小强度要求和质量精度等。自动化的数据评估和报告由沃特世EMPOWER?软件通过预定义的自定义字段(Custom Fields)完成，该功能允许用户输入最少的数据，并利用数据库字段数据计算输出值。预定义的自定义字段可自动评估ID标志物峰的信号强度、保留时间和质量差。最终的EMPOWER?报告方法汇总了所有方法和样品信息、获得的结果及其评估，并允许对分析数据进行符合GMP的审查和电子签名。报告以简单形式总结评估，并通过确认产品特异性ID标志物肽段来最终确认产品身份。
验证数据总结与全球网络实施现状
所描述的LC-MS检测方法已基于国际人用药品注册技术协调会(International Conference on Harmonization, ICH) Q2(R1)指南进行了通用性验证。为此，针对三种治疗性蛋白产品，独立详细考察了方法的特异性和稳健性。特异性验证要求所选ID标志物（至少2个）仅能在目标蛋白样品中检测到。迄今为止，为每个开发中的产品都已从理论上确定并实验证明了足够的ID标志物。对与样品制备、色谱分离和质量检测相关的参数进行了详细的稳健性考察，已验证的范围汇总在补充材料中。考察发现，所有参数/范围的变化仅影响ID标志物肽的信号强度，而建立的关于信号强度、保留时间和质量精度的接受标准始终得到满足。该方法的稳健性预计远超已验证范围。除了已证明的稳健性，其靶向质量检测的原理使其在日常操作中比之前使用的依赖肉眼评估数据的LC-UV方法更不易受到干扰。
沃特世ACQUITY QDa系统目前已在罗氏/基因泰ch遍布美国、欧洲、亚洲的QC网络中建立并通过GMP认证，并已在韩国和阿根廷的罗氏本地检测实验室实施。该系统常规用于临床和商业蛋白产品的身份放行检测。在监管申报方面，该检测系统已成为临床蛋白产品的标准身份测定方法，并已成功获批用于Ocrevus(Ocrelizumab)和Piasky(Crovalimab)两个新上市产品，更多申报已在计划中。目前，已准备了一份批准后变更管理协议(Post-Approval Change Management Protocol, PACMP)，以将所有商业产品切换至此新的LC-MS平台身份检测方法。该PACMP已于2026年1月全球提交给各卫生监管机构。
结论
将LC-MS肽图分析应用于产品身份检测，代表了在严格监管的制药环境中对既有检测策略的现代化革新。该方法成功地缓解了原有LC-UV系统的应用和稳健性问题，并显著提高了蛋白药物身份检测的特异性。由于可以补充到现有的超高效液相色谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC)系统中，且整体概念结合了自动化数据评估，使得该检测系统在全球罗氏/基因泰ch QC网络中的建立相对容易且成本不高，用户友好，无需实验室人员具备广泛的质谱专业知识。已有经验表明，身份检测中的实验室错误率可以降低，耗时的偏差和错误调查也能被最小化。此外，放行检测中记录的数据可用于进一步评估，因为它们允许对常规放行检测中未完全解析的生物工艺关键性能参数进行长期评估。例如，可以追踪氧化、脱酰胺等氨基酸修饰事件，并将数据用于评估长期工艺趋势以及当前生物工艺问题（包括根本原因分析的偏差管理）。而且，目前已记录的此类肽段修饰数据，在定量上与高分辨LC-MS/MS技术获得的数据具有可比性。近期发表的研究也证明，LC-MS QDa技术同样适用于定量放行检测，可用于评估电荷变体，并可能在药物产品层面替代常规的离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEC)用于放行检测。即使不对所述检测系统进行进一步优化，研究人员也能够在肽段水平检测和定量相关的关键质量属性(Critical Quality Attributes, CQAs)，如抗体重链恒定区(Fc)的N-糖基化和氧化，其结果与参考方法（如2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记N-糖的HILIC-UHPLC分析）获得的结果相当。因此，现已遍布罗氏/基因泰ch QC网络的LC-MS QDa技术，为产品属性的特异性评估提供了一种替代方案。原则上，这些评估可以被纳入身份检测的评估方案中。这种方法的定量方面需要根据ICH Q2(R1)指南进行成功验证，但这同样适用于目前使用的低分辨率常规方法（如IEC）以及现代高分辨率LC-MS/MS技术。
平台要求与方法
在试剂与材料方面，用于方法开发的生物制药蛋白由罗氏和基因泰ch提供。样品制备过程包括：将生物制药溶液用纯水稀释，取1毫克稀释后的蛋白，用含6 M盐酸胍、360 mM Tris和2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的变性缓冲液变性。随后用220 mM二硫苏糖醇(DTT)在37°C下还原10分钟。然后加入300 mM碘乙酰胺(IAA)在37°C下烷基化10分钟。烷基化样品通过预先平衡的PD-10或NAP-5脱盐柱进行脱盐。
酶切通过加入Lys-C内切蛋白酶溶液（酶与底物质量比为1:100），在45°C下孵育2小时完成，并通过加入10%三氟乙酸(TFA)溶液终止反应。
LC-MS测量使用沃特世ACQUITY UHPLC系统（H-Class或I-Class）与沃特世QDa I检测器联用完成。分析柱温度设置为80°C，流速为0.3 mL/min。根据所使用的UHPLC系统，采用不同的梯度程序以达到相同的分离效果。质谱检测使用连接的沃特世ACQUITY QDa I Performance质谱仪在正离子模式下进行。锥孔电压设为10 V，毛细管电压1.5 kV，探头温度600°C，质量范围150–1250 m/z，采样率≥2点/秒。3D质谱图通过EMPOWER?色谱数据系统在仅运行模式下采集。运行后数据处理使用产品特定的处理方法集进行。
数据评估方面，为简便和自动化，从3D质谱图中针对每个ID肽，使用其特定的m/z值生成相应的XIC。每个ID肽的XIC包含所有被分析蛋白ID肽的2D色谱图。使用EMPOWER?软件生成XIC时，用于提取的m/z值在方法集中被定义为“衍生通道”，并将“峰分离”值设为1.2000 Da，从而为数据采集提供±0.6 Da的质量容差。对提取的色谱图应用Savitzky-Golay滤波器进行19点平滑以获得一致的峰形。每个ID峰在其相应的MS通道中基于峰强度进行积分。在每条XIC中，强度最高的峰被积分并识别为相应的ID峰。为避免对低丰度和非特异性峰进行积分，峰高需超过预设的最小高度值（通常为500,000离子计数）才能被EMPOWER?软件自动积分。积分后，XIC中最高峰的保留时间会被自动测量和显示。如果预期的ID峰不存在，则不会进行积分，也不会显示保留时间，从而自动产生“身份不符”的检测结果。
EMPOWER?处理方法会返回XIC中已积分ID峰的2D-MS质谱图，并在每个理论平均m/z值的±0.6 Da容差窗口内找到最高m/z值。质量误差为每个预期m/z值的测量m/z与预期m/z之差的绝对值。为避免将噪声信号纳入考虑，在2D-MS质谱图中，找到的m/z值的“预期强度”必须大于或等于谱图中最强信号（基峰）强度的0.2%。
通过高分辨质谱对ID峰候选物进行表征
为实施使用QDa MS检测的通用肽图分析方法作为身份检测方法，所选ID峰候选物通过高分辨LC-MS/MS进行测序。在表征洗脱的产品特异性ID峰时，Lys-C酶切后的抗体在与LC-MS测量部分描述相同的条件下进行分离。ID标志物肽的质谱检测和CID碎裂在连接的沃特世Xevo G2-S质谱仪上以正离子模式进行。数据评估使用供应商特定软件（沃特世）完成。
