《Mycology》：Biotin synthesis and assimilation are vital for pathobiology of the insect pathogenic fungus Beauveria bassiana
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本研究系统揭示了昆虫病原真菌白僵菌（Beauveria bassiana）生物素（维生素B7）代谢的核心机制。研究发现，一个由BbBIOB、D和F三个基因组成的基因簇负责生物素合成，其缺失会严重损害真菌菌丝生长、孢子萌发、产孢及穿透昆虫体表的能力。外源生物素可恢复突变株的生长与毒力，表明真菌存在外源生物素利用机制。通过比较转录组学，研究首次在丝状真菌中鉴定出三个主要协助转运蛋白超家族（MFS）转运蛋白BbTrp1、BbTrp2和BbTrp4，证明其在低浓度生物素条件下介导生物素吸收，其中BbTrp1和BbTrp2更是毒力发挥所必需。该工作深化了我们对维生素代谢在昆虫病原真菌生理与致病过程中作用的理解。
1. 生物素合成基因簇的鉴定与亚细胞定位
生物信息学分析表明，昆虫病原真菌白僵菌的基因组中存在一个包含三个生物素合成基因（BbBIOB、BbBIOD和BbBIOF）的基因簇。与构巢曲霉和黄曲霉类似，白僵菌的BbBIOD基因编码一个双功能酶，兼具脱硫生物素合酶（BioD）和DAPA合酶（BioA）的活性。系统发育分析显示，白僵菌的这些生物素合成基因与另一昆虫病原真菌绿僵菌（Metarhizium acridum）的对应基因亲缘关系最近，表明在昆虫病原真菌中具有保守性。通过基因融合与荧光显微镜观察，明确了这些合成酶在细胞内的精确定位：BbBioB和BbBioD蛋白定位于线粒体，而BbBioF蛋白则位于过氧化物酶体中。
2. 生物素合成对白僵菌基本生理与毒力的关键作用
通过基因敲除（ΔBbbiob, ΔBbbiod, ΔBbbiof）和回补实验，研究人员系统地评估了生物素合成在白僵菌生命活动中的重要性。在缺乏外源生物素的基本培养基（CZA）上，三个基因敲除突变株几乎无法生长。随着外源生物素浓度（0-0.5 nmol/L）的增加，突变株的菌落直径逐渐恢复，表明它们高度依赖外源生物素。在贫瘠的水琼脂平板上，突变株的分生孢子萌发率也显著低于野生型，而添加生物素可使其恢复正常。
更为关键的是，生物素合成途径的完整性对真菌的毒力至关重要。在体壁感染（穿透昆虫体表）实验中，与野生型相比，三个敲除突变株的致死中时间（LT50）显著延迟，最终致死率降低。这种毒力缺陷在分生孢子从化学成分明确、以天冬酰胺（Asn）为氮源的ASN平板上培养时尤为明显。然而，在血腔注射（直接将孢子注入昆虫血淋巴）实验中，突变株的毒力与野生型无异。这一结果强烈暗示，昆虫体表是一个寡营养环境，可能缺乏生物素，因此真菌必须依赖自身的合成能力来启动感染和穿透过程；而一旦进入营养丰富的血淋巴，外源生物素的供应则可以弥补其合成缺陷。有趣的是，虽然以天冬酰胺为氮源可以完全恢复突变株在平板上的生长，却无法完全恢复其体壁感染的毒力，表明生物素在致病过程中的作用超越了单纯的生长需求。
3. 生物素化水平与表型缺陷的关联
通过蛋白质印迹实验检测了蛋白质的生物素化水平。在营养丰富的SDAY平板上，ΔBbbiob突变株的蛋白质生物素化水平与野生型相似。然而，在ASN平板上培养时，突变株的生物素化水平显著降低。当在ASN平板中外源添加生物素后，突变株的生物素化水平得以恢复。这表明，生物素合成途径直接影响细胞内蛋白质的生物素化修饰，而这种修饰的缺失与观察到的生长和毒力表型缺陷直接相关。
4. 白僵菌生物素转运蛋白的发现与功能鉴定
鉴于外源生物素可以“拯救”生物素合成缺陷突变株的表型，研究团队推测白僵菌必然存在吸收外源生物素的转运系统。为了寻找这些转运蛋白，他们对野生型和ΔBbbiob突变株在添加或不添加生物素的ASN平板上进行了比较转录组学分析。通过对差异表达基因（DEGs）的筛选和富集分析，并结合生物信息学比对，从主要协助转运蛋白超家族（MFS）中初步筛选出四个潜在的生物素转运蛋白编码基因，命名为BbTRP1至BbTRP4。同时，也鉴定了酵母生物素转运蛋白Vht1的同源物BbTRP5。亚细胞定位显示，这五个转运蛋白均定位于细胞膜和囊泡结构。
为了验证功能，研究人员构建了五个转运蛋白的单基因敲除突变株，以及将它们与ΔBbbiob背景结合的双敲除突变株。化学饲喂实验表明，在低浓度生物素（0.05-0.1 nmol/L）条件下，ΔBbtrp1ΔBbbiob、ΔBbtrp2ΔBbbiob和ΔBbtrp4ΔBbbiob双突变株的生长恢复程度显著差于ΔBbbiob单突变株。而在较高生物素浓度下，这种差异消失。这证明BbTrp1、BbTrp2和BbTrp4这三个MFS转运蛋白在低浓度环境下负责介导外源生物素的吸收。令人意外的是，酵母Vht1的同源物BbTrp5并未表现出明显的生物素转运功能。
5. 生物素转运蛋白在毒力中的不同角色
进一步的昆虫毒力实验揭示了这些转运蛋白在致病过程中的复杂功能。在血腔注射实验中，BbTRP1或BbTRP3的缺失会延迟毒力，而BbTRP2的缺失本身不影响毒力，但在ΔBbbiob背景下缺失BbTRP2（即ΔBbtrp2ΔBbbiob）则会导致毒力显著下降。这表明，在真菌进入血腔后，BbTrp2在利用宿主内源生物素方面扮演了比BbTrp1和BbTrp4更重要的角色。在体壁感染实验中，BbTRP1或BbTRP3的单独缺失几乎完全消除了真菌的毒力，而BbTRP2、BbTRP4或BbTRP5的单独缺失则影响不大。然而，在ΔBbbiob背景下缺失BbTRP2、BbTRP4或BbTRP5，都会进一步加剧ΔBbbiob原有的毒力缺陷。综合来看，BbTrp1和BbTrp3对穿透感染过程至关重要；BbTrp2主要在血腔生长阶段负责生物素吸收；而BbTrp4则在低浓度生物素吸收中起作用，但其在毒力中的功能具有条件依赖性。
6. 总结与展望
本研究首次在昆虫病原真菌白僵菌中系统解析了生物素合成与吸收的双重机制。生物素合成基因簇是维持真菌在寡营养环境下生长、发育和启动穿透感染所必需的。同时，真菌进化出了一套由多个MFS家族转运蛋白（BbTrp1, BbTrp2, BbTrp4）组成的冗余系统，用于在合成不足时从环境中摄取生物素，其中不同的转运蛋白在感染的不同阶段（体表穿透 vs. 血腔增殖）各司其职，共同保障了真菌在宿主体内的成功定殖与致病。这项工作不仅增进了对丝状真菌维生素代谢生理学的理解，也为开发针对昆虫病原真菌代谢弱点的新型病虫害防控策略提供了潜在靶点。未来的研究可以深入探索这些生物素转运蛋白的调控机制，以及天冬酰胺等特定氨基酸如何替代生物素部分功能的分子基础。
