《OncoImmunology》：Polarization of tumor-infiltrating macrophages predicts complete response to neoadjuvant treatment in patients with rectal cancer
文章内容总结
ABSTRACT
新辅助治疗后疗效的差异性是直肠癌治疗中的一大挑战。研究表明，肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞组成，特别是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，可能与治疗反应相关。TAMs可被极化，呈现促炎性(M1样)和抗炎性(M2样)表型，但将其极化谱作为预测生物标志物的潜力尚未被充分探索。本研究利用7重免疫荧光染色技术，量化了128名已知肿瘤消退分级(TRG)的直肠腺癌患者治疗前活检组织中16个TAM亚群。研究发现，在治疗后达到病理完全缓解(pCR)的患者中，完全M1极化亚群的密度更高，而完全M2极化亚群的密度更低。预测建模显示，只有这两个完全极化亚群的密度能够预测治疗反应。值得注意的是，本研究使用的全套标记物对于定义预测性细胞群是必需的，因为总TAMs或由较少标记物定义的TAM亚群无法预测治疗反应。总之，本研究验证了利用多重标记策略来定义TAM极化谱的实用性，可用于识别对新辅助治疗有病理完全缓解的患者。
Introduction
直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，手术是其主要的治疗方式，但术前(新辅助)治疗可降低局部复发率。患者对新辅助治疗的反应差异很大，约20%的局部晚期直肠癌患者能达到病理完全缓解(pCR)，即治疗后检测不到存活肿瘤细胞。这类患者可能从避免手术中获益。因此，在临床环境中识别可能达到pCR的患者具有重要价值，但目前尚无有效方法。
肿瘤微环境(TME)已成为理解治疗反应的一个有前景的研究方向。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是TME中数量最丰富的免疫细胞之一，在结直肠癌等多种人类癌症中存在。TAMs具有可塑性，可在环境刺激下发生极化，其表型在促炎性的M1样状态和抗炎性的M2样状态之间形成一个连续谱。既往研究在结直肠癌中探讨了TAMs的预后作用，结果存在矛盾。此外，对TAMs的评估常使用单个极化标记物，这限制了对巨噬细胞表型多样性的评估。单细胞RNA测序研究已显示出巨噬细胞的广泛异质性，但此类研究无法定义表型不同的TAM亚群的空间分布。因此，多重免疫荧光(mIF)已被用于研究结直肠癌患者的TAMs，以确定其M1/M2极化状态，并量化其在间质和上皮肿瘤区域的亚群丰度。
TAMs的M1/M2极化谱在直肠癌新辅助治疗反应中的可能预测作用尚未得到研究。为此，本研究使用了与M1表型相关的两个标记物(CD86和干扰素调节因子5)以及与M2表型相关的两个标记物(转录因子cMaf和甘露糖受体C型1)，这些标记物先前被用于与结直肠癌的长期生存相关的研究。本研究证明，对新辅助治疗有病理完全缓解的患者，其组织中完全M1极化TAM亚群(表达CD86和IRF5，但不表达cMaf或CD206)的密度更高，而完全M2极化TAM亚群(表达cMaf和CD206，但不表达CD86或IRF5)的密度更低。研究结果表明，揭示TAM表型的极化谱可用于预测直肠癌患者对新辅助治疗的反应。
Materials and methods
研究设计与参与者
研究共纳入了在瑞典哥德堡Sahlgrenska大学医院于2007年至2019年间诊断为直肠腺癌的1774名患者。最终，128名符合纳入标准且拥有可用诊断活检样本的患者被纳入研究。患者的临床数据来自瑞典结直肠癌登记处和病历。使用伪名化活检样本，并获得瑞典伦理审查机构的豁免知情同意批准。
肿瘤反应评估
通过苏木精-伊红染色评估所有患者的手术标本，并根据美国癌症联合委员会(AJCC)的肿瘤消退分级(TRG)标准评估治疗反应。TRG分为0至3级，其中0级表示病理完全缓解，3级表示对新辅助治疗无反应或无消退。参与制备和分析术前组织切片的调查人员在完成所有多重免疫荧光染色和分析，并启动统计分析之前，对TRG评分设盲。
多重免疫荧光染色
研究设计了一个多重免疫荧光(mIF)抗体组合，利用酪酰胺信号放大技术来表征巨噬细胞极化。该组合使用了两个M1标记物(CD86和IRF5)、两个M2标记物(cMaf和CD206)，以及泛巨噬细胞标记物CD68和泛上皮/肿瘤细胞标记物细胞角蛋白。对术前活检的4微米石蜡包埋切片进行染色，经过脱蜡、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、酪酰胺信号放大、抗体剥离(最后一个标记物除外)等步骤，最后用DAPI复染细胞核并封片。
图像分析
由病理学家检查所有诊断性H&E染色标本并标记侵袭性肿瘤区域，在免疫荧光染色切片上定位相应区域。使用配备7通道滤光片组的TissueFAXS扫描仪扫描免疫荧光染色切片，并使用StrataQuest软件进行分析。基于细胞角蛋白表达手动处理组织分割算法以定义上皮、间质和背景。排除高红细胞、自发荧光、组织折叠和坏死区域。使用DAPI定义细胞核，手动检查所有图像。由于切片间标记物染色强度存在差异，为每个标记物设定了强度阈值。通过手动计数验证软件定量细胞亚群的性能。
巨噬细胞表型分析与极化评估
CD68+细胞被定义为TAMs。通过将间质中检测到的TAM数量除以单个感兴趣区域(ROI)的间质组织面积来计算每个患者TME中TAMs的密度。然后使用CD86、IRF5、cMaf和CD206四个标记物将TAMs划分为16种特定表型。完全M1极化表型定义为CD68+IRF5+CD86+cMaf-CD206-；完全M2极化表型定义为CD68+IRF5-CD86-cMaf+CD206+。混合表型定义为同时具有M1和M2标记物的TAMs，M0 TAMs定义为不表达M1和M2标记物的TAMs。
统计分析
通过比较每个TRG类别与其余三个类别的联合，使用韦尔奇不等方差双样本t检验(双侧)进行预先定义的TAM亚群比较，并使用霍姆逐步下调程序调整p值以控制族错误率。为了对16种完整表型进行无偏筛选，首先使用韦尔奇单因素方差分析检验任何TRG效应，并使用本杰明-霍奇伯格错误发现率(FDR)控制所得p值。只有通过此筛选的表型才进行事后检验。使用自举LASSO逻辑回归模型(500次自举运行)研究16种巨噬细胞表型与TRG分期之间的关联，使用乐观校正后的Brier分数比较不同模型的性能，并使用乐观校正后的AUC值进行进一步说明。通过单侧威尔科克森秩和检验比较基于热图的免疫评分，并使用受试者工作特征(ROC)分析评估预测因子的二元判别能力。
Results
多重免疫荧光分析揭示了直肠癌中巨噬细胞极化的连续谱
为了评估TAMs的密度和极化，研究对128名直肠腺癌患者治疗前活检的肿瘤组织进行了7色多重免疫荧光(mIF)染色。CD68的表达被用作泛TAM标记物。然后，根据两个M1标记物(CD86和IRF5)和两个M2标记物(cMaf和CD206)为每个CD68+TAM分配特定表型。定义了完全M1极化、完全M2极化和混合表型，以分别评估TAM极化。这种方法通过揭示16个不同的CD68+TAM亚群，实现了对直肠癌巨噬细胞微环境的详细表型特征描述。
完全极化M1和M2亚群的密度在病理完全缓解患者中发生改变
接下来，研究量化了治疗前活检组织中特定TAM亚群在TME中的密度。研究发现，总巨噬细胞密度与TRG评分无显著关联。此外，当仅使用M1标记物或仅使用M2标记物来定义TAM极化亚群时，也未观察到与TRG评分的显著关联。这些发现表明，这些宽泛的TAM表型在具有不同治疗反应的患者中没有显著差异。
因此，分析扩展到包括四个标记物(IRF5, CD86, cMaf, CD206)的表达或不表达，从而产生16种不同的CD68+巨噬细胞亚群。研究发现，巨噬细胞亚群在所有巨噬细胞(CD68+)中的比例各不相同，其中M0巨噬细胞是最普遍亚群，而M1-+M2+-亚群丰度最低。
对所有16种TAM表型密度的无偏筛选确定了五种在TRG评分间存在显著差异的巨噬细胞亚群。结果显示，在治疗后达到病理完全缓解的患者中，观察到更高密度的完全M1极化巨噬细胞，并且这些患者的完全M2极化TAMs密度也低于TRG1、2或3的患者。此外，三个部分M2极化的巨噬细胞亚群在TRG 0患者中的密度显著更低。完全极化的M1和M2 TAMs密度之间存在微弱但显著的负相关。
完全极化TAM亚群的密度在pCR患者中都发生了显著改变。pCR患者中完全极化M1 TAMs密度升高，完全极化M2 TAMs和部分极化M2 TAMs密度降低。总之，这证明了TAM极化谱与新辅助治疗反应之间存在关联。
完全极化M1和M2亚群的密度可强有力地预测新辅助治疗的病理完全缓解
为了研究不同TAM表型对TRG分期的预测性能，使用了所有16种表型的密度作为预测因子。TRG分期被分为临床上最相关的组别：0级对1-3级(完全缓解者 vs 非完全缓解者)和0-2级对3级(缓解者/部分缓解者 vs 无缓解者)。研究旨在确定是否可以使用TAM亚群密度来预测将实现pCR的患者或不会从新辅助治疗中受益的患者。
使用自举LASSO逻辑回归模型研究TAM表型与TRG分期之间的关联。使用0.9的选择阈值，意味着在至少90%的自举样本中具有非零回归系数的变量被纳入模型。使用似然比检验和乐观校正后的Brier分数比较模型，并使用乐观校正后的AUC说明性能。
以TRG 0对1-3作为结果的Bolasso程序选择了M1++M2--和M1--M2++TAMs的密度作为预测因子。该模型的表观Brier分数为0.063，乐观校正后的Brier分数为0.07。表观AUC为0.905，支持其对TRG 0与TRG 1-3之间的判别具有优异性能。乐观校正后的AUC仅略低，为0.903，表明仅有轻微过拟合。当TRG分期被分组为0-2对3时，使用0.9的阈值，选择了三种表型。使用三个最常被选中的变量作为预测因子的逻辑回归模型的乐观校正后AUC仅为0.681，表明其在区分TRG 0-2与3组别方面的判别能力较低。
为了研究完全M1极化与完全M2极化TAMs的密度比值是否比单独的完全极化M1和M2 TAMs密度对TRG 0对1-3的结果具有更好的预测价值，使用M1:M2比值和完全极化TAM表型密度拟合了逻辑回归模型。模型间的似然比检验表明，M1:M2比值模型对数据的拟合度显著差于完全极化TAM模型。完全极化TAM模型具有最佳的乐观校正后Brier分数0.07，而M1:M2比值模型的乐观校正后Brier分数较差，为0.073。同时纳入M1:M2比值和完全极化TAM密度也未能提高模型性能。
研究组先前在同一患者队列中已证明，由间质中MxA表达细胞所识别的I型干扰素特征在TRG0中增加。此外，先前研究表明，将MxA作为独立参数添加到先前发表的CD8 T细胞免疫评分评估中，可改善对pCR的预测。然而，完全极化的M1或M2 TAMs的数量与MxA或CD8 T细胞的密度之间没有相关性。
研究使用完全极化的M1和M2 TAMs的密度生成一个仅包含完全极化巨噬细胞的巨噬细胞特异性免疫评分。此外，还生成了结合完全极化巨噬细胞、CD8 T细胞和MxA的免疫评分。基于CD3和CD8 T细胞密度的经典免疫评分在TRG0与TRG1-3之间显示出临界显著的增加。先前发表基于MxA和CD8 T细胞的双参数免疫评分在TRG0患者中显著更高。仅使用完全极化巨噬细胞亚群的巨噬细胞特异性免疫评分，以及包含完全极化巨噬细胞并结合MxA和CD8的免疫评分，在TRG0中均显著更高。
通过比较ROC AUC评估了不同免疫评分对分类TRG0与TRG1-3的判别性能。巨噬细胞特异性免疫评分显著优于经典免疫评分和先前发表的双参数免疫评分。巨噬细胞特异性免疫评分与基于完全极化巨噬细胞亚群、间质MxA+细胞和CD8 T细胞的四参数免疫评分之间没有显著差异。相应地，在Bolasso模型中同时纳入MxA和/或CD8 T细胞的密度与完全极化M1和M2 TAMs密度，并未提高预测性能。
这些结果表明，在治疗前活检中通过多重方法识别的两个离散TAM亚群(完全M1极化和完全M2极化)的密度，能够强有力地预测哪些患者将对新辅助治疗产生pCR。
Discussion
直肠癌肿瘤对新辅助治疗的反应存在差异，但目前尚无成熟的方法来预测这种反应以调整治疗。肿瘤微环境的免疫组成已被确定为预测新辅助治疗反应的潜在候选因素。鉴于髓系细胞群在此背景下尚未得到广泛研究，研究假设表征治疗前直肠癌活检中的巨噬细胞极化可用于识别免疫景观的新预测成分。
利用7重mIF，研究定义了直肠癌间质中巨噬细胞极化状态的连续谱。基于两个M1标记物和两个M2标记物的存在与否，定义了TAMs的离散亚群，产生了16种不同的表型。这种方法反映了学界共识，即巨噬细胞极化的M1/M2二分法过于简化，TAMs实际上存在于极化状态的连续谱中。支持巨噬细胞亚群更大异质性的证据来自结直肠癌TAMs的单细胞RNA研究，其描述了至少七种不同的TAM亚群。然而，单细胞RNA测序研究中描述的TAM亚群如何对应于本研究中由M1和M2标记物表达定义的表型，尚待阐明，这将是该领域的重要补充。已有研究表明，在单细胞研究中，CD86和CD206在RNA水平上广泛表达于巨噬细胞，这表明将本研究中使用的蛋白质定义的“M1/M2”状态直接映射到转录组表型具有挑战性，可能需要额外的蛋白质标记物，从而需要更高的组织多重检测能力。
使用多个标记物定义TAM极化的重要性得到了本研究发现的强调。在本研究中，无论总巨噬细胞数量还是仅由M1或M2标记物共表达定义的巨噬细胞亚群，均无法用于确定对新辅助治疗的反应，即间质中CD68+IRF5+CD86+或CD68+cMaf+CD206+巨噬细胞的密度与TRG评分无显著关联。然而，当同时表征M1/M2标记物的表达以定义完全极化的M1和M2亚群时，研究确定了TAM亚群与新辅助治疗反应之间的关联。研究证明，在将达到新辅助治疗pCR的患者中，存在完全M1极化巨噬细胞密度增加和完全M2极化巨噬细胞密度减少的现象。完全极化TAM亚群密度也能够强有力地预测pCR，其乐观校正后的AUC值达到0.903。
支持本研究发现的证据包括，在直肠癌中对治疗前活检进行批量RNA测序分析发现，对新辅助治疗反应良好的患者中M2标记物CD163的表达降低。此外，免疫组化染色显示，在治疗前的活检中，反应良好患者的CD163表达低于反应不良患者，尽管这仅在有限数量的活检中进行了评估。另一项研究也描述了在pCR患者的治疗前直肠癌活检中，CD163以及M2巨噬细胞相关因子MCSF的表达降低。然而，单独使用CD163或与MCSF联合使用来预测pCR，得到的AUC值分别为0.77和0.79，表现差于本研究的多重方法。另一项单独使用M2标记物CD206的研究未发现应答者和无应答者之间的表达差异，进一步强调了应用多标记物方法的重要性。总之，研究证明，使用多标记物方法来定义TAM极化谱可以识别能够强有力地预测新辅助治疗pCR的完全极化巨噬细胞亚群。
在其他实体瘤中也有关于M1/M2极化在新辅助放化疗治疗前预测能力的证据。在宫颈癌的一项研究中，与低M1:M2比值的病例相比，具有高M1:M2比值(由TAMs中pSTAT1和c-MAF表达定义)的患者更常经历完全pCR。此外，低M1:M2比值是放化疗反应不良的独立预测因子。在食管癌中也报道了高浸润的M2巨噬细胞(由CD163和CD206表达定义)与新辅助治疗反应不良之间存在显著关联。在乳腺癌中发现，对新辅助治疗缺乏有益反应与M2巨噬细胞表型的存在相关。最后，在胰腺癌中，发现新辅助化疗的良好应答者中上皮内M1极化TAMs的密度更高。此外，新辅助治疗肿瘤中M1极化TAMs的更高密度和与肿瘤细胞的更近距离，与改善的肿瘤组织学反应相关。因此，在直肠癌以外的肿瘤中，肿瘤微环境中存在的M1:M2平衡可以与随后的新辅助治疗反应相关联。
在肿瘤微环境中，M1和M2 TAMs发挥不同作用的潜在机制有多种。简而言之，抗肿瘤的M1样TAMs会吞噬肿瘤细胞，并向淋巴细胞有效呈递抗原，从而增强抗肿瘤免疫反应；而M2样TAMs则通过分泌抗炎介质参与促肿瘤效应。在新辅助放化疗反应的背景下，极化巨噬细胞的作用可以是直接或间接的。巨噬细胞极化受肿瘤微环境的细胞和生化环境影响。IFNγ通常与M1极化相关，I型IFN信号传导也与巨噬细胞的炎症表型相关。在直肠癌新辅助治疗完全应答者中，已发现I型和II型IFN信号传导以及IFN诱导的细胞因子CXCL10水平升高。相反，TME中TGFβ信号传导增强可驱动M2极化。增强的TGFβ信号传导已被直接与对新辅助治疗反应受损相关联。此外，部分由TGFβ信号传导升高定义的直肠癌共识分子亚型被发现与缺乏pCR相关。总之，完全极化的M1和M2巨噬细胞可以分别反映富含IFN和TGFβ信号传导的肿瘤微环境。由于这些信号传导程序与新辅助治疗结果密切相关，巨噬细胞极化可以作为间接指示免疫和间质信号传导程序的指标，这些程序塑造了治疗反应性。
也有证据表明极化巨噬细胞可以直接调节对新辅助治疗的反应。M2极化TAMs分泌的CXCL7已被证明通过代谢重编程的肿瘤细胞赋予化疗耐药性。此外，M2巨噬细胞来源的CCL22已被证明可防止化疗诱
