《Biology》：Development and Application of Two Rapid Molecular Detection Assays for Hyblaea puera Cramer (Lepidoptera: Hyblaeoidea), a Major Pest of Mangroves and Teak
Shengbo Zhao,
Dezhi Kong,
Yunpeng Liu,
Qinghua Wang,
Yaojun Zhu and
Liangjian Qu
1. 引言
森林生物入侵作为一种全球性现象，对生物多样性与林业资源构成了前所未有的威胁。在中国，主要入侵物种已对森林生态系统造成严重损害，其影响常超过本土害虫。因此，针对潜在入侵物种的研究已成为当代林业科学的重要课题。及时检测与准确鉴定是制定有效管理策略与检疫措施的基础前提。
柚木潜叶蛾（Hyblaea puera，鳞翅目：柚木潜蛾科）是一种原产于南亚和东南亚（如印度、老挝、缅甸）的害虫，主要危害柚木（Tectona grandis）和白骨壤（Avicennia marina）。该物种于1975年首次在中国记录，最初局限于主要柚木种植区。2010年，H. puera在广西的红树林中被发现取食白骨壤叶片。2015年爆发了一次大规模疫情，影响了约300公顷红树林，导致大面积落叶和白骨壤死亡。由于其发育周期短，在广西沿海地区每年可完成多达11代，对中国红树林生态系统构成了持续且严重的威胁。该害虫现已扩散至包括陕西和甘肃在内的多个省份，显示出从其原始南方分布区向北扩张的趋势。
准确鉴定H. puera的卵、幼虫和蛹期仍然具有挑战性。尽管将形态学方法与DNA条形码技术结合是一种可行方法，但它需要专业的分类学知识和实验室设备，且耗时较长，并受限于现有参考数据库的覆盖范围和准确性。此外，从红树林地区灯光诱捕器收集的标本常常已分解或降解，严重影响了鉴定的可靠性。相比之下，针对单一基因的物种特异性PCR（SS-PCR）是一种高效可靠的分子检测方法，已广泛用于重要入侵物种的鉴定。由于线粒体基因具有母系遗传、高拷贝数、结构保守且无重组等特点，常被选作开发SS-PCR的理想靶标。然而，尽管SS-PCR方法简单高效，但其对实验室基础设施的要求限制了其应用，特别是在H. puera的现场鉴定方面。
环介导等温扩增（LAMP）技术由Notomi等人首次开发，是一种广泛应用的核酸扩增技术。与传统扩增方法相比，LAMP具有操作更简单、特异性与灵敏度更高、结果可视化更简便的优点。尽管最初在医学诊断中应用突出，但近年来LAMP在昆虫学领域也显示出巨大潜力。然而，其高灵敏度也使其易受气溶胶污染，且所需的可视化试剂可能带来安全问题并增加操作成本。因此，并行开发SS-PCR和LAMP方法能更好地适应不同场景下的检测与监测需求。
目前，缺乏针对H. puera的快速现场检测方法是对有效监测体系的重大挑战。因此，亟需开发经济高效、无需复杂设备且结果可视化的检测方法，以支持一线检疫和害虫管理工作。为满足不同检测场景的实际需求，本研究旨在建立和优化两种互补的检测方案，以构建适用于实验室和野外环境的分层筛查策略。
基于Shah等人利用H. puera及相关物种的线粒体基因组建立的系统发育树，本研究选择了亲缘关系密切的物种进行比较分析。提取了线粒体蛋白质编码基因（PCG）序列，并进行了滑动窗口分析以计算核苷酸多样性（Pi）值。此方法能够筛选出最优靶基因，用于开发SS-PCR和LAMP检测方法，以支持对H. puera更快速、准确的鉴定。
2. 材料与方法
2.1. 样品采集与DNA提取
于2024年6月至8月期间，从广西、广东和云南的四个地点采集了H. puera的幼虫标本。幼虫在其各自寄主植物上饲养至成虫羽化。根据形态特征，将成虫鉴定为H. puera。成虫随后保存在无水乙醇中，并于-80 °C储存。此外，H. puera的卵、幼虫和蛹样本由中国林业科学研究院生态保护研究所昆虫病理与昆虫病原体研究组提供。实验对照组包括以下物种：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）、印度谷螟（Plodia interpunctella）和桃蛀螟（Dichocrocis punctiferalis）。使用DNA提取试剂盒按照制造商说明从所有样品中提取基因组DNA。
2.2. 靶基因选择
基于Shah等人重建的系统发育树，从NCBI数据库检索了H. puera（GenBank: MW885970）以及来自草螟科的四个相关物种——二化螟（Chilo suppressalis， GenBank: MK207057）、小蔗螟（Diatraea saccharalis， GenBank: FJ240227）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis， GenBank: MN793323）和欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis， GenBank: AF442957）的线粒体基因组。使用Geneious Prime 2025软件提取并比对13个PCG。使用DnaSP v6软件进行滑动窗口分析，窗口大小为200 bp，步长为20 bp。选择具有最低核苷酸多样性（Pi）值的基因作为靶标标记。
2.3. H. puera特异性引物设计与PCR方案
提取2.2节所述选定物种的COI基因序列，使用Geneious Prime 2025软件进行比对。筛选出在H. puera种内高度保守且与非目标物种间具有高度特异性的区域。基于这些区域，设计了三对特异性引物。所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。
PCR扩增在25 μL反应体系中进行，包含2 μL DNA模板（832 ng/μL）、1 μL正向和反向引物（各10 μM）、12 μL DNA聚合酶和9 μL ddH2O。温度梯度PCR循环条件如下：95 °C预变性5分钟；随后进行20、25或30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒，在55 °C至58 °C梯度内退火30秒（单个反应间隔1 °C），72 °C延伸30秒；最后72 °C延伸10分钟。每次运行均设置以ddH2O代替DNA模板的阴性对照。
为可视化扩增产物，取9 μL PCR产物与1 μL 10× 上样缓冲液混合，在浸于1× TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。电泳在80 V下进行10-15分钟。随后使用凝胶成像系统观察并拍照。
2.4. SS-PCR检测方法的特异性和灵敏度验证
使用通用COI基因引物LCO1490和HCO2198对所有昆虫样本提取的基因组DNA进行质量验证。所有样本均产生约650 bp的扩增产物，证实了DNA模板的完整性，可用于后续PCR分析。PCR试剂和循环条件与2.3节所述相同，只是退火温度调整为43 °C。
SS-PCR方法的特异性主要通过测试H. puera的DNA模板与非目标对照物种的DNA模板进行评估。该方法的稳健性进一步通过使用来自不同地理种群和不同发育阶段的H. puera样本DNA进行了验证。为确定检测灵敏度，对H. puera DNA进行10倍系列稀释。每个实验进行三次独立重复。稀释系列的浓度为：83.2 ng/μL, 8.32 ng/μL, 0.83 ng/μL, 83 pg/μL, 8.3 pg/μL, 0.83 pg/μL, 83 fg/μL, 8.3 fg/μL, 和 0.83 fg/μL。
2.5. H. puera特异性LAMP引物设计与反应体系建立
使用在线Primer Explorer V5工具设计LAMP引物。以FASTA格式输入靶基因序列，并调整引物设计参数以满足特定实验要求。引物F3和B3的Tm值范围为54-56 °C，3‘端稳定性（ΔG）值≤ -4 kcal/mol，GC含量为40-50%。基于这些结果，选择了一组最优引物，包含两对引物：外引物（F3和B3）和内引物（FIP和BIP）。所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。
为防止气溶胶污染，每个反应管中的反应混合物上覆盖50 μL液体石蜡。LAMP反应总体积为25 μL，包含12 μL 2× BcaBest Buffer，2 μL 10× LAMP Primer Mix，1 μL BcaBest DNA聚合酶，2 μL DNA模板和8 μL ddH2O。
温度梯度LAMP反应在60 °C至65 °C梯度内进行30分钟，然后在85 °C下酶灭活15分钟。随后，向每个管中加入1 μL稀释10,000倍的SYBR Green I染料。根据混合物颜色变化可视化结果：绿色表示阳性结果，橙色表示阴性结果。
2.6. LAMP检测方法的特异性和灵敏度验证
LAMP检测方法的特异性和灵敏度验证遵循2.4节描述的相同程序。
2.7. 用于H. puera检测的LAMP-LFD方法的建立
为通过侧向流动试纸条（LFD）实现检测，对引物进行了修饰，在FIP引物的5‘端标记生物素（Biotin），在BIP引物的5’端标记FITC。LFD检测试纸条购自常州安普未来生物科技有限公司。
LAMP扩增后，取10 μL反应产物用190 μL无菌水稀释并充分涡旋。随后，将80 μL稀释后的样品加样到LFD试纸条的加样口。大约在控制线（C线）显现后1-2分钟观察结果。只有在控制线出现后15分钟内观察到的结果才被视为有效。
3. 结果
3.1. 基于核苷酸多样性选择靶基因
分析了5个线粒体基因组中13个蛋白质编码基因（PCG）的核苷酸多样性（Pi）值。单个基因的Pi值范围在0.12至0.20之间。Pi值最高的三个基因是ND2（0.18）、ND6（0.20）和ATP8（0.20），而Pi值最低的基因是COI（0.12）、COII（0.13）和ND5（0.14）。鉴于COI基因表现出最低的核苷酸多样性，因此被选为开发快速检测方法的靶基因。
3.2. SS-PCR检测方法的特异性、稳定性和灵敏度
使用通用COI引物成功扩增了H. puera及相关物种的基因组DNA，得到约650 bp的产物，证实了DNA模板的完整性，适合后续实验。设计并评估了三对靶向COI基因的引物对。PCR的最佳退火温度确定为58 °C，较低的温度会显著增加非特异性扩增。循环数优化为25个，因为更少的循环会降低检测灵敏度，而更多的循环会促进引物二聚体的形成。在特异性测试中，引物组3（HPCOIF-3/HPCOIR-3）表现出高特异性，仅从H. puera中扩增出一条清晰的602 bp片段。非目标物种：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、亚洲玉米螟、稻纵卷叶螟、印度谷螟和桃蛀螟均未观察到扩增。使用来自不同地理种群和不同发育阶段的H. puera提取的DNA评估了该方法的稳定性。引物组3在所有样本中均产生清晰的扩增。使用H. puera DNA的10倍系列稀释进行灵敏度测试，确定引物组3的检测限为83 fg/μL，表明其灵敏度足以满足快速检测需求。
3.3. LAMP检测方法的特异性、稳定性和灵敏度及反应条件优化
通过实验筛选确定最佳反应温度为65 °C，因为较低温度会导致显色不足，从而影响结果的准确判读。特异性测试表明，含有H. puera DNA模板的反应在加入指示剂后产生阳性结果（颜色变化）。相比之下，含有所有非目标物种（草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、亚洲玉米螟、稻纵卷叶螟、印度谷螟、桃蛀螟）DNA的反应均为阴性，证实了该方法的高特异性。使用来自不同地理种群和不同发育阶段的H. puera DNA进行的稳定性测试表明，LAMP引物始终能产生清晰的阳性结果。灵敏度评估确定LAMP方法的检测限为8.3 fg/μL，表明其具有高灵敏度，足以满足快速检测需求。
此外，使用标记了生物素（FIP）和FITC（BIP）的引物，扩增产物成功在侧向流动试纸条上实现可视化。LAMP-LFD检测方法仅对H. puera DNA产生阳性结果，而所有测试的非目标物种均为阴性。这证实了该检测方法在LFD平台上的特异性得以保持。这些结果表明LFD与LAMP的有效整合，建立了一个快速、经济高效的检测平台。
4. 讨论
有效管理H. puera严重依赖于在种群爆发前检测侵染的能力，特别是考虑到该害虫的迁飞行为和快速的种群增长。我们在广东、广西和云南的实地调查揭示了种群数量的急剧波动和季节性变化，这与之前在印度记录的迁飞模式一致。为满足早期预警系统的关键需求，本研究开发并评估了两种不同的分子诊断工具：物种特异性PCR（SS-PCR）检测方法和与侧向流动试纸条（LFD）可视化联用的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。尽管两种方法都能成功将H. puera与七种同域分布的鳞翅目物种区分开，但关键的比较揭示了它们不同的性能特征和适用场景。
SS-PCR检测方法展示了卓越的特异性和稳定性，在所有测试的目标物种发育阶段和地理种群中，均能稳定扩增出COI基因的一条清晰的602 bp片段。其主要优势在于常规热循环技术的稳健性，该技术在受控实验室条件下被认为是准确性的“金标准”。该方法涉及PCR扩增和DNA片段分析等标准程序，使其非常适合设备齐全的实验室进行诊断应用。然而，它并不适用于野外现场的快速检测。此外，SS-PCR的检测限确定为83 fg/μL，表明其灵敏度显著低于LAMP方法。
针对H. puera的LAMP检测方法表现出显著更高的灵敏度，其8.3 fg/μL的检测限比SS-PCR方法提高了十倍。如此高的灵敏度与为其他入侵害虫检测开发的等温扩增方法（例如针对Hylurgus ligniperda的RPA或针对草地贪夜蛾的LAMP）相当甚至更高，这些方法通常也在飞克（fg）级别运行。能够检测如此低浓度的DNA对于侵染的早期识别至关重要，因为此时目标材料通常有限。此外，传统的比色法LAMP检测可能受主观视觉判读的影响，而LFD可视化的集成通过确定检测线（T线）的有无提供了更明确的结果。LAMP-LFD检测方法无需热循环仪和凝胶电泳，有效克服了野外诊断的操作限制，为现场检测提供了一种快速、经济高效的方法。
凭借其飞克级别的灵敏度，LAMP-LFD检测方法能够检测痕量样品，包括单个卵、低龄幼虫，甚至可能沉积在寄主植物上的环境DNA（eDNA）残留。这种高灵敏度对于H. puera这种具有强飞行能力的高度迁移性害虫的常规监测尤为重要。此外，该检测方法在不同地理来源的个体和所有生命阶段中均表现良好，确保了无论害虫来源或发育阶段如何都能可靠检测，从而防止监测覆盖出现潜在空白。
尽管取得了这些有希望的结果，但应承认当前研究的几个局限性。首先，虽然使用七个关键的共生物种评估了特异性，但红树林生态系统的高度生物多样性要求未来与更广泛的非目标生物进行验证，以明确排除与罕见特有物种的交叉反应。其次，由于我们的检测方法主要在受控实验室条件下使用高质量基因组DNA进行了验证，因此其性能——特别是LAMP-LFD检测方法——需要使用粗提DNA或直接组织裂解法进行进一步评估。考虑到环境污染物在野外样本中的潜在抑制效应尚未完全探索，这一点尤为重要。最后，现场验证使用的样本量相对有限。虽然这些样本为现场适用性提供了初步的概念验证，但小样本量和可能较窄的地理覆盖范围可能无法完全反映目标密度或不同地区H. puera种群遗传多样性的自然变异。解决这些局限性将是未来工作的重点，以优化这些检测方法，使其适用于大规模、稳健的现场应用。展望未来，将这些分子工具与灯光诱捕和雷达监测等常规监测技术相结合，为更好地理解H. puera爆发的驱动因素提供了一种有前景的途径。未来的工作应侧重于验证LAMP-LFD检测方法用于处理从诱捕器收集的环境DNA（eDNA）或混合昆虫样本的能力。克服当前在样品制备和现场验证方面的挑战，对于推动这些检测方法从实验室研究走向保护红树林生态系统的实用工具至关重要。
5. 结论
本研究成功开发了两种针对线粒体COI基因的高效分子检测方法——SS-PCR和LAMP，用于快速鉴定入侵害虫H. puera。两种检测方法均表现出卓越的特异性和稳定性，能够准确区分H. puera与非目标物种，且不受不同发育阶段和地理种群的影响。SS-PCR检测方法为实验室确认提供了可靠的解决方案，而LAMP检测方法则提供了更高的灵敏度（检测限8.3 fg/μL）和效率。此外，将LAMP与LFD技术集成，实现了便捷、无需仪器的可视化检测，使其非常适合资源有限的野外环境进行监测。该检测方法显示出作为快速筛查工具融入国家检疫计划的巨大潜力，可显著提高拦截准确性和效率，防止该害虫的跨境传播。此外，该技术可整合到数字监测系统中，赋能一线人员实现早期爆发预警和精准林业防控，从而实现更有效的田间管理。总而言之，这些技术克服了形态学鉴定的局限性，为H. puera的早期检测、种群监测和及时防控提供了强有力的工具，从而有助于保护红树林和森林生态系统。
