利用耐盐碱植物促生长内生菌提升紫花苜蓿耐盐碱能力的研究

《Biology》：The Application of Saline–Alkali-Tolerant Growth-Promoting Endophytic Bacteria for Enhancing the Saline–Alkali Tolerance of Alfalfa Muhammad Rahman Ali Shah, Lu Tang, Hao Zhou, Huiying Zheng, Yimeng Shi and Changhong Guo

本研究从中国东北盐碱地苜蓿根系中分离到四株耐盐碱内生菌，鉴定显示其为近缘的蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌及成团泛菌。研究证实，该等菌株可产生ACC脱氨酶、铁载体、吲哚乙酸(IAA)并具溶磷能力，显著增强了紫花苜蓿在盐碱胁迫下的株高、根长、生物量等生长指标，提升了根活力、脯氨酸、可溶性蛋白含量及抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性，降低了活性氧(H2O2、O2-)与膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)水平。特别是菌株SYM-15，在大田试验中使苜蓿产量提高34.5%，粗蛋白增加13.3%，同时降低了中性与酸性洗涤纤维含量，展示出开发为环境友好型生物肥料、提升边际土地作物生产力的巨大潜力，为可持续农业发展提供了有效策略。

　　

引言

土壤盐碱化是制约全球农业生产的严峻非生物胁迫。盐碱胁迫不仅降低土壤水势，限制植物对水分和养分的吸收，高pH值更会降低磷、铁等必需元素的溶解度和有效性，对作物生长构成严重威胁。紫花苜蓿作为重要的多年生豆科牧草，其“牧草之王”的美誉源于其高蛋白含量、强大适应性和固氮改良土壤的能力。然而，盐碱胁迫会显著抑制其生长发育，导致生物量下降。利用植物促生长内生菌是缓解盐胁迫的一种有前景的生物修复策略，与根际微生物相比，内生菌定殖于植物内部组织，提供了更稳定、受保护的小生境，能够更直接、系统地调节植物的生理响应。然而，多数现有研究聚焦于中性盐（如NaCl）胁迫，对兼具高盐和高pH的盐碱复合胁迫关注不足。本研究旨在从生长于盐碱土壤的苜蓿根系中分离耐盐碱内生菌，评估其促生长潜力，为开发适用于盐碱环境的苜蓿接种剂奠定基础。

材料与方法

研究团队从中国黑龙江省哈尔滨市兰西县的黑龙江草原研究所试验基地采集了生长在盐碱地上的紫花苜蓿植株。通过严格的表面消毒、研磨、梯度稀释，并使用添加了7% NaCl且pH调节至9的LB培养基，成功分离出四株能在盐碱条件下生长的内生菌株，编号为SYM-2、SYM-4、SYM-9和SYM-15。通过16S rDNA测序构建系统发育树，并结合菌落形态观察和生理生化鉴定，确定了它们的种属：SYM-2与蜡样芽孢杆菌亲缘关系最近，SYM-4与苏云金芽孢杆菌最近，SYM-9与耐盐芽孢杆菌最近，而SYM-15与成团泛菌最近。

研究评估了这些菌株的关键植物促生长特性。测定结果显示，所有菌株均能产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶，活性在5.32至16.52 μmol α-酮丁酸·mg^-1蛋白·h^-1之间，其中SYM-15活性最高。在铁载体测定中，SYM-2和SYM-15表现出较强的铁载体生产能力。在溶磷能力方面，SYM-15释放的有效磷含量最高，达到268.62 μg·mL^-1。所有菌株均能合成吲哚乙酸(IAA)，且产量随L-色氨酸浓度的增加而增加，在500 μg·mL^-1色氨酸条件下，SYM-15的IAA产量最高，为11.10 μg·mL^-1。

通过盆栽试验，研究者评估了这些菌株在盐碱条件下对苜蓿的促生长效果。试验土壤pH为8.40，电导率为288 μs·cm^-1。苜蓿种子经菌悬液浸泡后播种，并在生长过程中定期浇灌菌液。对照组则使用等量无菌水。试验测定了植株的生长参数、生理生化指标及抗氧化酶活性。

结果

1. 1.
   促生长效果
   与对照组相比，接种四种内生菌均显著提高了盐碱胁迫下苜蓿的株高、根长和生物量。其中，菌株SYM-15的促生长效果最为突出：使株高增加33.90%，根长增加27.94%，地上部鲜重和干重分别增加49.07%和59.26%。
2. 2.
   生理生化响应
   接种菌株显著改善了苜蓿的生理状态。根活力提升了11.23%至40.38%。作为渗透调节物质，游离脯氨酸含量增加了19.09%至129.87%，可溶性蛋白含量增加了7.71%至42.49%。在抗氧化防御系统方面，过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性均显著提高，其中POD活性增幅最大，达7.15%至70.77%。与此同时，代表氧化损伤的指标显著下降：过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂^-)含量增加幅度小于对照组（意味着相对损伤更小），而膜脂过氧化的关键产物丙二醛(MDA)含量则显著降低了12.62%至37.94%。特别值得注意的是，在盆栽试验中，与对照组及其他处理（包括SYM-9）相比，SYM-15处理显著提高了苜蓿的过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，同时显著降低了过氧化氢含量。
3. 3.
   大田试验验证
   鉴于SYM-15在盆栽试验中的卓越表现，研究者将其用于大田试验。结果显示，接种SYM-15使苜蓿产量显著提高34.55%，粗蛋白含量增加13.35%。同时，苜蓿的磷含量增加了11.09%，而中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量则分别显著降低了3.43%和5.06%。这表明SYM-15不仅提高了产量，还改善了苜蓿作为饲料的营养品质。

讨论

本研究分离的四株内生菌均表现出多种植物促生长特性，如ACC脱氨酶活性、IAA产生、溶磷及铁载体产生。这些特性共同作用，帮助植物应对盐碱胁迫。ACC脱氨酶可降低胁迫诱导的乙烯水平，缓解生长抑制；IAA促进根系发育；铁载体和溶磷作用则提高了植物对铁、磷等限制性养分的可利用性，这在碱性条件下尤为重要。

盐碱胁迫会导致活性氧(ROS)积累，造成氧化损伤。本研究中，接种菌株通过提升抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性，增强了苜蓿的ROS清除能力，从而降低了H₂O₂、O₂^-和MDA的水平，保护了细胞膜结构。渗透调节物质脯氨酸和可溶性蛋白的积累有助于维持细胞渗透平衡，提高保水能力。

菌株SYM-15表现最佳，可能与其兼具高ACC脱氨酶活性、强溶磷能力、铁载体产生及高IAA产量等多种优势性状有关。其在大田试验中成功提升产量和品质，证明了其实际应用潜力。纤维含量的降低可能与胁迫缓解后植物减少了作为防御机制的木质素沉积有关，使得更多资源可用于蛋白质合成，从而提升了饲用价值。

结论

本研究成功从中国东北盐碱地的紫花苜蓿根系中分离出四株耐盐碱内生细菌，分别近缘于蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌和成团泛菌。这些菌株具备ACC脱氨酶活性、IAA合成、溶磷（及部分菌株的铁载体产生）等多种促生长特性。在盐碱条件下，接种这些菌株，特别是SYM-15，能通过增强抗氧化防御、促进渗透调节物质积累、降低氧化损伤等多重机制，显著促进紫花苜蓿的生长，提高其生物量、产量和营养品质（粗蛋白增加，纤维含量降低）。该研究为开发用于盐碱地农业的、环境友好的微生物接种剂提供了优质的菌种资源，展示了利用植物-微生物互作实现边际土地可持续农业生产的有效途径。