斑点热群立克次体（SFG Rickettsia）双重靶标一步法巢式PCR检测技术的开发与评估

《Pathogens》：Development and Evaluation of a Dual-Target One-Step Nested PCR for the Detection of Spotted Fever Group Rickettsia spp. in Ticks Phiaw Chong Foo, Canedy Jacob, Christina Injan Mawang, Ernieenor Faraliana Che Lah and Mariana Ahamad

本研究开发了一种可同步检测斑点热群立克次体（SFG Rickettsia）17 kDa 和 ompA 基因的双重靶标一步法巢式PCR方法，并集成了以疟原虫TRAP基因为基础的内标（IAC）。该方法相较于传统巢式PCR，操作更简便、耗时更短，且有效降低了交叉污染风险，为斑点热立克次体（Rickettsia spp.）的分子检测提供了一种高灵敏度、高特异性的可靠工具，尤其适用于资源有限的监测或研究实验室。

　　

1. 引言

蜱是重要的人畜共患病原体节肢动物媒介，其独特之处在于能够携带并通过长期附着和经卵传播等方式，传播包括细菌、病毒和原虫在内的多种病原体。一只蜱在单次吸血过程中即可携带和传播多种病原体，因此其媒介作用具有重要的医学意义。立克次体属（Rickettsia）细菌是重要的蜱相关病原体，可对人类和动物健康构成重大风险。这些感染主要通过蜱叮咬传播，可引起从轻度发热性疾病到严重全身性疾病的一系列疾病。随着全基因组测序技术的发展，立克次体被划分为四个主要系统发育支系：始祖群（AG）、斑点热群（SFG）、斑疹伤寒群（TG）和过渡群（TRG）。其中，斑点热群因其导致人类急性发热性疾病而具有特殊的临床相关性。其传播可在蜱叮咬后迅速发生，临床常见表现包括高热、头痛和形态多样的皮疹，严重或未经治疗的病例可能累及中枢神经系统和心血管系统。

针对蜱传疾病的早期诊断，分子检测技术因其在感染早期的高灵敏度而日益受到青睐。然而，常规的巢式PCR（nested PCR）需要两轮独立的扩增步骤，耗时较长且因多次开管操作而易于发生交叉污染。尽管实时荧光定量PCR（real-time PCR, qPCR）非常高效，但其需要专用仪器且运营成本较高，在资源有限的环境中可及性较低。在马来西亚等东南亚国家，虽然多项研究已报告了蜱、野生动物和家畜中存在斑点热群立克次体，表明存在持续的人类暴露风险，但针对蜱的常规分子筛查尚未标准化，现有检测方法多局限于研究层面。

为此，本研究旨在开发一种内部（in-house）单步巢式PCR检测方法，能够同时扩增两个立克次体靶基因，并引入一个基于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）血小板反应蛋白相关匿名蛋白（thrombospondin-related anonymous protein, TRAP）基因的外源性内部扩增控制（internal amplification control, IAC），以监控PCR抑制并区分真阴性结果与扩增失败。

2. 材料与方法

2.1. 试剂与仪器

所有寡核苷酸由Integrated DNA Technologies（新加坡）合成。PCR试剂购自Thermo Fisher Scientific。PCR反应在Mastercycler Pro S vapo.protect（Eppendorf）上完成。扩增产物通过Owl EasyCast水平凝胶电泳系统（Thermo Fisher Scientific）分析，并使用UVP ChemStudio Series（Analytik Jena）成像。所有样本使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）进行DNA提取。

2.2. 引物设计

选择了立克次体17 kDa表面抗原（17 kDa）基因和外膜蛋白A（outer membrane protein A, ompA）基因作为双靶标检测的目标。针对每个靶基因，设计了三引物系统：一个共同正向引物、一个外部反向引物和一个内部反向引物。此配置使得巢式扩增能够在单个反应管内进行。引物结合位置如图所示。

靶向立克次体17 kDa基因的引物命名为FC-0011、R1-0011和R2-0011，靶向立克次体ompA基因的引物命名为FC-0012、R1-0012和R3-0012。内部扩增控制（IAC）使用引物对F-IC-0014和R-IC-0014，其扩增子大小为268 bp，该IAC基于恶性疟原虫TRAP基因设计，因其与蜱或立克次体基因组无已知同源性，可确保在不与靶标模板竞争或引起非特异性扩增的情况下，有效监控PCR抑制剂。

2.3. 双重靶标一步法巢式PCR的配制

最终反应体系为20μL，包含优化的引物浓度：1.2 μM FC-0011, 0.5 μM R1-0011, 0.2 μM R2-0011, 1.5 μM FC-0012, 1 μM R1-0012, 0.5 μM R3-0012, 0.25 μM F-IC-0014 和 0.25 μM R-IC-0014，以及1× PCR缓冲液、2.5 mM MgCl₂、0.44 mM dNTPs混合物、3.75 U Taq DNA聚合酶、1 pg合成TRAP基因DNA和2 μL目标DNA模板。PCR程序为：95 °C 5 min；随后40个循环（95 °C 30 s, 60.5 °C 30 s, 72 °C 30 s）；最后72 °C延伸5 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.4. 样本检测与数据分析

使用从2018年和2019年马来西亚彭亨州和登嘉楼州森林地区采集的184份经形态学和分子鉴定的蜱标本进行检测。在DNA提取前，蜱样本经过盐酸清洗、70%乙醇中和、蒸馏水漂洗，并人工捣碎。使用开发的双重靶标一步法巢式PCR 对所有蜱样本的总基因组DNA进行立克次体属检测。任何扩增出的PCR产物均送至First BASE Laboratories进行测序，所得序列通过NCBI数据库的BLASTn算法进行分析。

3. 结果与讨论

3.1. 双重靶标一步法巢式PCR的开发

利用基于17 kDa和ompA基因的合成DNA构建体，对双重靶标单步巢式PCR检测法进行了优化和标准化。优化结果（凝胶电泳）如图所示。

三个短的合成DNA片段（对应17 kDa、ompA和TRAP基因）被用作检测的阳性对照和内部扩增控制（IAC）模板。TRAP基因在添加蜱DNA提取物之前被预先掺入检测试剂混合物中。IAC旨在通过确认PCR后在琼脂糖凝胶上成功扩增出IAC特异性条带，从而验证阴性结果的准确性，排除因共同提取物抑制PCR而导致的假阴性可能。

传统的巢式PCR需要进行两次独立的扩增运行，而本研究开发的双重靶标一步法巢式PCR检测仅需单次反应运行。所有用于外部和内部扩增步骤的引物均被预先混合于一个反应管中并同时发挥作用。图2展示了阴性和阳性对照反应的PCR产物图谱。

3.2. 双重靶标一步法巢式PCR的性能表现

为评估所开发检测方法的性能，进行了分析灵敏度测试以确定其检测限（limit of detection, LoD），并与使用相同引物组的传统巢式PCR进行平行比较。检测使用10倍系列稀释的合成17 kDa和ompA DNA模板（从1 × 10⁸到 1 个基因拷贝）进行。所开发的检测方法表现出与传统巢式PCR相当的灵敏度。对于立克次体属ompA基因的检测，所开发方法的检测限为1000个基因拷贝，而传统巢式PCR的灵敏度较低，检测限为100,000个基因拷贝。对于17 kDa基因靶标，所开发方法和传统巢式PCR均表现出相同的检测限，均为10个基因拷贝（如图所示）。

8基因拷贝；2, 1 × 10⁷基因拷贝；3, 1 × 10⁶基因拷贝；4, 1 × 10⁵基因拷贝；5, 1 × 10⁴基因拷贝；6, 1 × 10³基因拷贝；7, 100基因拷贝；8, 10基因拷贝；9, 1基因拷贝。红色箭头指示各自检测方法观察到的最低可检测稀释度（检测限）。">

针对17 kDa抗原基因的分子检测方法此前已有报道，本研究开发的方法对17 kDa基因的检测限为10个基因拷贝，与早期基于传统巢式PCR检测的灵敏度相当。相比之下，ompA基因由于片段较大且在斑点热群立克次体物种间存在序列变异，通常更难扩增。然而，本检测方法在该靶标上优于传统巢式PCR，实现了100倍更低的检测限。

本研究开发的双重靶标一步法巢式PCR相较于传统巢式PCR方案的一个主要优势是其闭管形式。标准巢式PCR需要在两轮扩增之间打开反应管，这大大增加了气溶胶污染的风险。而本研究的方法将所有引物整合到单次反应中，消除了这一步骤，从而降低了污染风险并缩短了总处理时间。此外，以TRAP基因作为IAC，为结果提供了额外的质量保证。蜱组织中含有已知的PCR抑制剂，可能导致假阴性结果，因此通过阳性IAC信号确认成功扩增，可以可靠地区分真阴性和无效反应。

尽管实时荧光定量PCR（qPCR）目前被认为是检测斑点热群立克次体的标准方法，但其需要专用仪器、荧光探针和专门的实验室基础设施。相比之下，本研究开发的方法可以使用常规PCR仪和标准琼脂糖凝胶电泳完成，同时保持了高分析灵敏度。尽管本研究未包含与qPCR的直接实验比较，但其简化的单管形式、更低的污染风险和更低的设备要求，支持了该方法作为补充工具的潜在用途，适用于无法轻易获得实时PCR平台的蜱媒监测和研究实验室。

3.3. 样本检测结果

在本研究中，使用双重靶标一步法巢式PCR对184份蜱基因组DNA样本进行了立克次体属筛查。结果仅发现一份（0.54%）样本为立克次体属阳性，该样本分离自采集自马来西亚彭亨州的粒形硬蜱（Ixodes granulatus）。对17 kDa基因的序列分析显示，与立克次体sp. ATT（登录号AF483196）具有100%的相似性。图4a展示了未检测到立克次体属基因的琼脂糖凝胶图像，而图4b则展示了一份针对立克次体sp. 17 kDa基因的阳性结果。

本研究观察到的0.54%的低流行率，与马来西亚及更广泛的东南亚地区蜱种群中立克次体属的局灶性和偶发性分布情况一致。在粒形硬蜱中鉴定到立克次体sp. ATT具有生态学意义，因为粒形硬蜱先前已被确定为马来西亚半岛蜱传病原体的潜在媒介。

4. 结论

总之，本研究开发的双重靶标一步法巢式PCR检测方法代表了一种强大且实用的立克次体分子检测工具。通过在单管形式中同时靶向17 kDa和ompA基因，该检测方法提供了达到或超过传统巢式PCR的分析灵敏度（特别是对于ompA靶标），同时显著减少了处理时间并降低了实验室污染风险。内部扩增控制（IAC）的整合通过排除PCR抑制导致的假阴性，进一步确保了诊断的可靠性。最终，这种简化的方法为常规监测和研究实验室提供了一种可行的、具有成本效益的替代方案，有助于加强蜱传疾病的监测，并支持在流行地区进行早期病原体检测。