《Fermentation》：Functional Characterization of ccpA in Heyndrickxia coagulans Reveals Coordinated Regulation of Carbon Catabolite Repression and L-Lactic Fermentation
Ji Yin,
Pingping Liu,
Shiwei Wang,
Changtao Wang,
Dongdong Wang,
Jiachan Zhang,
Dan Zhao and
Meng Li
编辑推荐：
本期推荐一篇聚焦工业微生物代谢调控的深度研究。该文在凝固芽孢杆菌 (Heyndrickxia coagulans) 中，通过构建ccpA基因敲除（ΔccpA）及回补菌株，系统阐明了碳代谢抑制蛋白A (CcpA) 作为核心调控因子的双重功能：它不仅主导碳代谢抑制 (CCR) 以调控混合糖利用，更是维持同型乳酸发酵表型、驱动碳通量流向L-乳酸 (L-lactic acid) 的关键开关。该研究为基于代谢工程 (metabolic engineering) 优化高产菌株提供了坚实的理论依据。
1. 引言
L-乳酸是一种多功能的平台化学品，在食品、制药、化妆品和化工行业中具有广泛应用。特别是光学纯的L-乳酸，是合成生物可降解塑料聚乳酸（PLA）的重要单体，其全球需求正快速增长。在众多生产路线中，利用可再生碳水化合物进行微生物发酵，已成为大规模生产L-乳酸最具经济竞争力和环境友好性的方法。在众多的乳酸生产微生物中，凝固芽孢杆菌 (H. coagulans) 作为一种耐热、兼性厌氧细菌脱颖而出，它能在较高温度（最适50-55°C）下生产光学纯L-乳酸，产量超过200 g/L，对葡萄糖的得率高于0.90 g/g。其固有的耐热性、耐低pH和产孢能力，进一步支持了工业上可进行开放式（非无菌）发酵，显著降低了运营成本和污染风险。
然而，高效共利用混合糖仍然是H. coagulans面临的一个重要代谢挑战。在大多数革兰氏阳性菌中，优先碳源（如葡萄糖）的存在会抑制替代糖分解代谢所需基因的表达，这种调控现象被称为碳代谢抑制 (CCR)。CCR导致糖的序贯利用模式，延长了发酵时间，降低了整体工艺效率。在低G+C含量的革兰氏阳性菌中，CCR主要由代谢控制蛋白A (CcpA) 介导，它是LacI/GalR家族的转录调节因子。研究表明，CcpA的调控范围已超越典型的CCR，涵盖了对中心碳代谢和发酵途径选择的直接控制。尽管如此，CcpA在H. coagulans中的功能尚未被系统研究。本研究通过构建ccpA缺失突变体（ΔccpA）及其回补菌株，从生理、代谢、酶活和转录组多个层面进行了全面表征，旨在阐明CcpA在该工业重要菌种碳代谢调控中的核心作用。
2. 材料与方法
研究以H. coagulansATCC 7050为亲本菌株，利用温敏型穿梭载体pMAD，通过两步同源重组策略，构建了无标记的ccpA缺失突变体（ΔccpA），并利用穿梭载体pHY300PLK构建了回补菌株（C-ccpA），通过菌落PCR和RT-qPCR验证了菌株构建的成功（）。实验评估了菌株在以葡萄糖、木糖及二者混合物为碳源时的生长曲线和糖利用情况。通过高效液相色谱（HPLC）定量了发酵产物（L-乳酸、乙酸、甲酸、乙醇）。测定了关键代谢酶L-乳酸脱氢酶 (LDH) 和乙酸激酶 (ACK) 的活性。在混合碳源条件下，对野生型（WT）和ΔccpA菌株进行了比较转录组学分析。最后，在5L生物反应器中进行了放大批式发酵，以验证摇瓶规模的表型在工业相关条件下的可重复性，并进行了碳平衡计算。
3. 结果
3.1. ΔccpA缺失及回补菌株的验证
通过菌落PCR和RT-qPCR，证实了ccpA基因的成功缺失以及回补菌株中ccpA表达的恢复。
3.2. ccpA缺失对细胞生长和碳源利用的影响
当葡萄糖作为唯一碳源时，所有菌株生长和消耗葡萄糖的动力学相似。在以木糖为唯一碳源时，ΔccpA菌株的木糖消耗速率有中等程度的增强。在混合糖（葡萄糖+木糖）条件下，最显著的表型得以显现：所有菌株均在约9小时内完全消耗葡萄糖，但ΔccpA菌株开始消耗木糖的时间显著提前，速率也更快，最终实现了更高的总糖利用效率，生长曲线也略高于WT和C-ccpA菌株（）。这表明CcpA的缺失解除了碳代谢抑制 (CCR)，使得H. coagulans能够实现葡萄糖和木糖的同步利用。
3.3. ccpA缺失将碳通量从L-乳酸重定向至混合酸产物
在发酵终点，WT和C-ccpA菌株产生了高浓度的L-乳酸（约92-98 g/L），而乙酸、甲酸和乙醇的含量仅为痕量。与之形成鲜明对比的是，ΔccpA菌株的L-乳酸产量急剧下降至约21 g/L，同时乙酸、甲酸和乙醇的积累量显著增加（）。时间进程分析显示，ΔccpA菌株的乳酸积累在约20 g/L时即达到平台期。这表明CcpA是维持H. coagulans同型乳酸发酵表型的核心，其缺失触发了从L-乳酸发酵到混合酸发酵的代谢转变。
3.4. ccpA缺失降低LDH活性并提高ACK活性
酶活测定为上述代谢转变提供了生化基础。在WT和C-ccpA菌株中，LDH活性在指数生长后期达到峰值（约28-30 U/mg蛋白），而ΔccpA菌株的LDH活性在所有时间点均显著降低，峰值仅为~13 U/mg蛋白。相反，ΔccpA菌株的ACK活性则呈现明显且渐进式的增加，在24小时达到约12 U/mg蛋白，显著高于WT和C-ccpA菌株（~1-2 U/mg蛋白）（）。这些数据表明，CcpA正调控LDH活性，同时抑制ACK活性，从而维持碳流向L-乳酸的代谢平衡。
3.5. 转录组分析揭示CcpA对中心代谢的广泛调控
比较转录组学分析显示，在混合糖条件下，ΔccpA与WT相比有60个差异表达基因。功能富集分析表明，这些基因主要富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢等相关通路。RT-qPCR验证了关键基因的表达变化：编码L-乳酸脱氢酶的ldhL基因在ΔccpA中显著下调，而编码丙酮酸甲酸裂解酶 (pflB) 和乙酸激酶 (ackA) 的基因则显著上调（）。这些转录水平的变化与观察到的代谢和酶活表型完全一致，证实CcpA是ldhL的转录激活因子，同时是混合酸发酵基因的抑制因子。
3.6. 生物反应器规模的发酵证实了ccpA缺失引起的代谢转变
5L生物反应器中的放大发酵结果，在受控条件下确证了摇瓶规模的观察。WT菌株展现了强劲的生长和高效的L-乳酸发酵，乳酸产量为94.5 g/L，对葡萄糖的得率为0.95 g/g。而ΔccpA菌株的生长受损，最大比生长速率降低了44.8%，发酵时间延长至36小时。最重要的是，其L-乳酸产量降至16.5 g/L（下降了82.5%），而乙酸和甲酸的产量则分别急剧增加至36.2 g/L（增加24.1倍）和25.8 g/L（增加51.6倍）（）。碳平衡分析进一步量化了这种代谢重分布：在WT菌株中，90.2%的消耗碳被导向乳酸；而在ΔccpA菌株中，仅有24.5%的碳通量流向乳酸，大部分碳被重新分配至乙酸（35.2%）、甲酸（16.8%）和乙醇（13.2%）。
4. 讨论
本研究系统揭示了CcpA在H. coagulans中扮演的双重调控角色。一方面，它通过典型的碳代谢抑制 (CCR) 机制，塑造菌株对混合糖（葡萄糖和木糖）的层级利用模式。ccpA的缺失解除了这种抑制，使得菌株能够同步利用多种碳源，这对于以富含木糖等五碳糖的木质纤维素水解物为原料的工业发酵过程具有重要价值。另一方面，也是本研究发现的核心，CcpA是维持H. coagulans同型乳酸发酵表型不可或缺的“主开关”。它通过正调控ldhL（激活乳酸生成）和负调控pflB、ackA等基因（抑制混合酸途径），在丙酮酸分支点精确控制碳通量的流向，从而确保高产、高得率的L-乳酸生产。ccpA的完全缺失虽然解除了CCR，但也导致乳酸生产的“崩溃”，转变为混合酸发酵模式。
这一“此消彼长”的关系为理性代谢工程提供了清晰的思路。未来的菌株改造方向可能不是简单地敲除ccpA，而是进行更精细的调控，例如：通过靶向改造特定基因启动子区的代谢响应元件 (cre) 位点，选择性地解除对木糖利用基因的抑制，同时保留对乳酸合成基因的激活；或采用可调启动子对ccpA进行时空调控，在发酵前期降低其活性以促进混合糖共利用，在后期恢复其活性以最大化乳酸产量；亦或在ΔccpA背景中，通过强化表达LDH、弱化混合酸途径来重建乳酸合成通量。这些策略旨在实现高效混合糖利用与高产乳酸得率的“双赢”，从而推动H. coagulans在工业生产中的应用潜力。
