《Water》：Responses of Microbial Community Structure and Carbon, Nitrogen, and Sulfur Metabolic Potential in the Chishui River to Disturbances from the Characteristic Baijiu Industry
Lan Zhang,
Song Liu,
Pinhua Xia,
Hui Wang,
Bi Chen,
Chun Qing and
Xianfei Huang
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本篇研究以赤水河流域为对象，综合运用水文地球化学与宏基因组学技术，揭示了特色白酒工业对河流生态系统的潜在影响机制。研究发现，酿酒业干扰改变了微生物群落结构，增强了微生物网络的不稳定性，并显著富集了异化硝酸盐还原、硫氧化、固碳及产甲烷等功能基因，为流域生态保护与可持续发展管理提供了科学依据。
赤水河流域微生物对白酒工业干扰的响应
1. 引言
河流是维系人类健康、社会经济发展与生物多样性保护至关重要的淡水资源。近年来，快速的城镇化导致大量工业废水与生活污水的排放，造成河水pH失衡、重金属浓度升高以及氮(N)、磷(P)等营养盐水平超标。水质持续恶化常与水生生物多样性下降相关联，对河流生态系统的结构与功能完整性及其关键生态系统服务价值构成压力，可能阻碍区域可持续发展。因此，深入研究工业发展对河流生态系统的影响，对于指导河流水体的综合治理与水生态功能的精准调控具有重要现实意义。
微生物是河流生态系统的基本组成部分，驱动着养分循环、有机物降解和能量流动等基本生态过程，是评估水质影响与生态系统功能的理想指示生物。然而，人为污染物的排放通常会降低微生物多样性并干扰其正常功能。不同来源和组成的废水会引发不同的微生物响应。现有研究主要关注城市污水处理厂出水对河流微生物群落多样性及组成的影响。然而，在农业面源污染与工业废水的复合干扰下，微生物的响应机制尚不清晰。填补这一知识缺口不仅有助于揭示多重压力下河流生态稳定性的微生物学机制，也为评估和监测工业活动的生态影响提供科学依据与微生物指标支撑。
除了群落组成的变化，人类干扰对微生物功能过程的影响也值得关注。工业发展不仅重塑了微生物群落的结构，也与碳(C)、氮、硫(S)等关键元素循环过程的调控密切相关。赤水河是长江上游南岸的一级支流，是该流域中上游段的关键生态屏障。流域内的茅台镇区域酿酒工业高度集中。随着白酒生产行业的快速扩张及流域内工矿用地转换的增加，区域原生生态环境面临的压力日益增大。虽然对赤水河流域水质、沉积物理化性质及微生物组成影响的研究已较为丰富，但关于该流域微生物介导的碳、氮、硫代谢功能基因响应机制的报道仍相对匮乏。本研究旨在：（1）调查微生物群落结构及碳、氮、硫代谢相关功能基因的空间分布；（2）阐明白酒生产区及赤水河流域微生物群落结构与元素代谢功能动态之间的关联模式。
2. 材料与方法
研究于2024年7月（流域雨季及白酒生产高峰期）在赤水河流域自茅台镇至习水镇河段设立了13个采样点，构成一个空间梯度。该梯度依次覆盖了三个典型区域：以原始森林为主的上游背景区、以白酒工业为核心的核心区以及以农业活动为特征的下游过渡区。对每个站点的水质参数（如水温、pH、溶解氧(DO)、电导率(EC)、总氮(TN)、总磷(TP)等）进行了现场测量与实验室分析。通过宏基因组测序技术分析了微生物群落组成与功能基因。使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit提取样品总DNA，在Illumina NovaSeq/HiSeq X Ten平台上进行测序。对原始数据进行质量控制、拼接组装和开放阅读框(ORF)预测，构建非冗余基因集。利用DIAMOND软件比对京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库，对氮、硫、碳循环相关的功能基因进行注释。使用R语言和Origin等软件进行统计学分析，包括α/β多样性分析、主坐标分析(PCoA)、共现网络构建、中性群落模型(NCM)分析、冗余分析(RDA)以及偏最小二乘路径模型(PLS-PM)分析等，以探究环境因子与微生物群落及功能基因间的关联。
3. 结果
3.1. 关键水文地球化学参数沿河流梯度呈现显著空间分异
水文地球化学参数数据显示，海拔(EL)、pH、DO、EC和TN在河流上游、核心区和下游之间存在显著差异。核心区的pH值略高于上游和下游，而DO浓度在上游最高，TN浓度上游也显著高于核心区和下游。此外，EC在上游和核心区之间也存在显著差异。TP、NH4+-N、SO42-、叶绿素a(Chl. a)、高锰酸盐指数(CODMn)和NO3--N在不同区域间未观察到显著变化。
3.2. 微生物群落组成与多样性沿河流梯度呈现显著空间分异
宏基因组测序揭示了不同区域微生物群落组成和多样性的明显变化。在所有样品中，假单胞菌门(Pseudomonadota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinomycota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)是优势门，平均相对丰度超过70%。其中，假单胞菌门的相对丰度从上、中、下游呈现先增后减的趋势，而拟杆菌门和放线菌门的相对丰度逐渐降低。下游的尾病毒门(Uroviricota)、芽孢杆菌门(Bacillota)和浮霉菌门(Planctomycota)的相对丰度显著高于上游和核心区。优势物种从上游的装甲菌门(Armatimonadota)转变为下游的纤毛虫门(Ciliophora)。
在属水平上，相对丰度大于0.01%的属的数量从上游、核心区到下游逐渐增加。上游和核心区的主要优势属是Limnohabitans、Candidatus Planktophila和Sediminibacterium，而下游的主要优势属是Acinetobacter、Limnohabitans和Thalassiosira。在空间尺度上，微生物群落多样性存在显著差异。Chao1和Ace指数显示，下游的α多样性高于上游和核心区，而Simpson和Shannon多样性指数无显著差异。β多样性指数在上游、核心区和下游区域之间存在显著差异。Venn分析显示，三个区域共享的微生物群落包含31,960个OTU，占总数的80.15%。下游区域具有最高的物种特异性，拥有1302个独特OTU，其次是核心区，有1296个独特OTU。基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析(PCoA)显示，前两个主坐标分别解释了群落组成总变异的66.9%和11.2%，上游、核心区和下游的样本形成了明显的独立聚类，表明微生物群落沿河流连续体存在清晰的空间隔离。
3.3. 共现网络与中性模型分析揭示微生物群落互作与构建过程的转变
共现网络分析显示，上游网络包含128个节点和866条连接，核心区为103个节点和214条连接，下游为118个节点和2738条连接，上游和核心区网络中正相关关系的比例均超过80%。微生物网络的节点和边数在上游和中游样本中显著低于下游。网络的拓扑连通性和结构复杂性沿流向增加，上游网络结构最为简单。下游区域的网络模块性显著低于上游和核心区，下游微生物群落的网络稳定性相对较弱。
中性模型和标准化随机性比率(NST)分析揭示了确定性过程与随机过程在群落构建中的平衡状态。中性模型对微生物群落的整体拟合优度顺序为：上游>核心区>下游。基于迁移率m，顺序为上游>核心区>下游，物种扩散程度从上游到下游逐渐降低。NST分析表明，上游背景区和核心区的NST值均超过0.5，这些区域的群落构建主要由随机过程驱动。相比之下，下游区域的NST值降至0.34，确定性过程显著增强并占据主导地位。
3.4. 功能基因分析揭示碳、氮、硫代谢潜力沿梯度的明显变异
我们观察到与同化硝酸盐还原、异化硝酸盐还原(DNRA)、固氮和有机氮代谢相关的功能基因丰度较高。然而，与反硝化作用相关的基因（如narG、nirK/S、norB/C/Z）丰度显著降低。同时，与硫代硫酸盐氧化、硫代硫酸盐歧化、硫化物氧化、亚硫酸盐氧化、碳固定以及产甲烷相关的基因在上游和核心区表现出更高的丰度。
碳、氮、硫相关功能基因的丰度在上游、核心区和下游之间呈现显著的空间变异。在氮循环中，nosZ基因的差异高度显著。在硫循环中，tst基因和soeA基因的存在高度显著。控制卡尔文循环固碳的cbbL基因的表达在下游显著高于上游和核心区。
3.5. 多元统计分析揭示环境因子对群落结构及代谢潜力的关键驱动作用
Spearman相关分析表明，多个关键水文地球化学参数与主要微生物门级类群的丰度，以及碳、氮、硫循环关键功能基因的丰度之间存在显著相关性。总体而言，无机氮和基本水文参数是影响微生物分类组成的关键变量。功能基因的响应更为复杂，有机氮代谢基因受多个水质参数正向调控，硫循环基因主要与海拔、五日生化需氧量(BOD5)和水温相关，而核心固碳基因受较少因子（如NH4+-N和pH）正向调控。冗余分析(RDA)进一步揭示了环境因子与碳、氮、硫代谢相关功能基因空间分布的相关性模式。Mantel检验进一步证实，硫、碳、氮循环相关的功能基因与特定环境因子（如TN、BOD5、EL等）和微生物群落结构显著相关。偏最小二乘路径模型(PLS-PM)分析了微生物群落结构和功能潜力的驱动因素，结果显示地理因素对微生物β多样性有显著负效应，并通过影响水质因子间接影响碳、氮、硫相关功能基因的丰度。
4. 讨论
4.1. 白酒工业显著影响微生物群落的空间异质性
本研究发现，赤水河流域上、中、下游的微生物群落多样性存在显著差异。特别是核心区和下游区的微生物多样性显著增加，下游区的优势物种和属更为多样。这一现象可能与核心区酿酒尾水的输入以及下游农业面源污染的叠加效应有关。韦恩分析揭示下游区拥有最多的独特OTU，为外部输入提供了直接证据。在空间生态过程方面，核心区微生物群落的构建过程以随机过程为主，群落间的扩散程度显著低于上游。这种随机性增强与扩散受限的矛盾模式可能与核心区存在的双重人为压力源有关。
4.2. 白酒工业驱动下微生物碳、氮、硫代谢潜力的响应机制
与反硝化作用相关的功能基因在上游表现出较高的相对丰度，并在下游降低，而与硝酸盐异化还原(DNRA)相关的功能基因在下游相对丰度增加。上游较弱的干扰和森林凋落物分解产生的有机物为反硝化细菌群落提供了碳源，这与反硝化相关基因的富集有关。相比之下，下游农业活动更剧烈，这与DNRA基因的富集相关。下游农业活动可能通过重金属/抗生素污染破坏微生物生境或抑制反硝化菌群。此外，下游区域反硝化基因丰度降低而DNRA基因丰度增加的现象，可能主要由硝酸盐可利用性变化和碳负荷改变共同驱动。
碳固定和产甲烷功能基因在核心区富集，而在上游和下游受到抑制。碳固定基因可能在耐受有机负荷的细菌中高表达，这些细菌通过β-氧化途径分解酿酒废水中的长链脂肪酸。产甲烷基因的富集可能与核心区特殊的碳源输入有关，一些产甲烷古菌具有利用酿酒副产物甲醇进行甲基营养型产甲烷的代谢能力。在强烈人为影响的核心区，我们观察到硫氧化基因的显著富集，这表明该区域的硝酸盐富集很可能由白酒工业驱动，促进了硫氧化过程。酿酒工业废水输入的溶解性或颗粒有机物在河流中被硫酸盐还原菌降解产生无机硫化氢，进而导致编码黄素细胞色素硫化物脱氢酶的基因丰度显著增加。
4.3. 环境、群落与功能的级联响应机制
上游高海拔、高DO的氧化性环境，结合森林凋落物提供的天然碳源，构成了核心筛选压力，直接筛选出以Limnohabitans等好氧细菌和反硝化细菌为主的群落结构。在该区域，反硝化基因相对丰度较高，硝化-反硝化成为氮循环的主导路径。在核心区，受酿酒废水输入影响，DO降低，BOD5和EC升高，pH微升至8.37–8.49，有机负荷成为新的筛选压力。在此环境下，拟杆菌门等异养细菌类群富集，酿酒废水引入的外源微生物显著扩大了物种库。低DO和高有机碳赋予DNRA细菌类群竞争优势，使DNRA基因取代反硝化基因成为氮循环的核心；此外，高SO42-和有机负荷共同驱动了硫氧化基因的富集。研究发现，叶绿素a浓度与固碳基因cbbL丰度呈显著正相关，且二者均在下游处于较高水平，表明浮游植物的光合作用是驱动该流域自养固碳过程的重要因素。
5. 结论
本研究揭示了白酒工业对赤水河微生物群落结构及碳、氮、硫代谢潜力的影响。与上游背景区相比，工业核心区至下游过渡区的微生物群落α/β多样性显著增加，而共现网络模块性降低，群落稳定性下降。群落形成过程呈现出随机性减弱、确定性增强的趋势，物种扩散受到限制。此外，在白酒工业影响下，与异化硝酸盐还原、硫氧化、碳固定和产甲烷相关的基因丰度增加，而反硝化基因丰度降低。这些功能基因丰度的变化可能与酿酒废水排放通过引入外源物种和营养底物有关，反映了白酒工业对当地河段微生物群落结构及碳、氮、硫代谢潜力造成的干扰。这些发现也为河流管理提供了实际意义。将微生物指标纳入常规监测计划可作为生态系统退化的早期预警信号。应优先控制酿酒废水中的氮输入，并加强河岸缓冲带建设以减轻氮负荷。此外，未来的监测工作应包括硫酸盐、硫化物和甲烷通量的测量，以全面评估工业活动的生态影响。
