《Horticulturae》：Genome-Wide Association Study Identifies Candidate Genes Associated with Vegetative Organ Coloration in Grapevine (Vitis vinifera L.)
Zhongyi Yang,
Liufei Huang,
Yangshengkai Xu,
Congling Fang,
Liru Wang,
Zhihui Chen,
Chao Yu and
Yueyan Wu
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本研究利用GWAS（全基因组关联研究）技术，首次在葡萄中系统解析了叶、梢、茎等营养器官着色性状的遗传结构。作者在151个葡萄种质资源中鉴定了8个着色性状，通过两年表型数据结合高深度重测序，利用MLM（混合线性模型）关联出13个稳定的显著SNP位点，并进一步锁定了3个表达水平与着色强度呈显著正相关的关键候选基因（VIT_06s0004g03620、VIT_16s0039g01900、VIT_14s0083g01050）。该工作不仅为理解葡萄适应环境压力的分子机制提供了新视角，也为通过分子育种改良葡萄观赏性与抗逆性奠定了重要基础。
引言
葡萄营养器官的着色，包括叶片、嫩梢和茎秆呈现红色或紫色，是一种重要的表型性状，与植物的环境响应和胁迫适应密切相关。花青素是导致这些器官着色的主要水溶性类黄酮色素，除了赋予颜色，还在光保护、抗氧化防御和非生物胁迫响应中发挥关键作用。尽管葡萄果实中花青素合成与调控的分子网络已有深入研究，MYBA1、MYBA2等关键转录因子已被鉴定，但对营养器官着色的遗传基础却知之甚少。鉴于该性状在生态适应、生理功能和品种识别中的重要性，系统阐明其遗传调控机制具有重要的理论价值和育种应用前景。本研究旨在利用GWAS（全基因组关联研究）方法，系统解析葡萄营养器官着色性状的遗传结构，识别相关位点与候选基因。
材料与方法
研究材料选自151个葡萄种质资源，均来自中国浙江省宁波市的葡萄种质资源圃。在连续两年内，对嫩梢茸毛花青素强度、幼叶上表面颜色、幼节腹/背面色、幼节点腹/背面色、成熟叶主脉花青素强度和一年生茎秆表面颜色这八个着色性状进行了系统评估与打分。基于前期完成的全基因组重测序数据，获得了超过562万个高质量SNP位点，用于GWAS分析。研究采用混合线性模型和一般线性模型进行关联分析，并使用邦弗朗尼校正和经验阈值确定显著性。以稳定显著的SNP位点为中心，在其上下游15 kb区间内筛选候选基因，并通过功能注释和KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析其潜在功能。此外，还利用实时荧光定量PCR技术分析了关键候选基因在“银红”葡萄不同组织及在不同着色梯度品种中的表达模式。
结果
营养器官着色性状的变异与相关性分析
对151个种质八个性状的统计分析表明，不同性状间存在显著的表型变异。嫩梢茸毛花青素强度的变异系数最高，表明其受遗传因素影响较大；而茎秆表面颜色变异系数较低，相对稳定。所有性状的广义遗传力均接近1，说明表型变异主要由遗传因素控制。相关性分析显示，同一性状在两年间呈极显著正相关，再次证明了表型的遗传稳定性，而不同性状间的相关性较弱，暗示它们可能受不同的遗传网络调控。
全基因组关联研究
通过比较，MLM模型在控制假阳性方面表现更优。基于此模型的分析发现，幼节背面色、幼节点背面色、成熟叶主脉花青素强度和茎秆表面颜色这五个性状在连续两年中稳定地与相同的SNP位点关联。最终，共鉴定出13个在两年间均稳定显著的SNP位点，分布于第3、5、6、13、14、15、16和18号染色体上，单个位点可解释13.28%至19.35%的表型变异。值得注意的是，其中6个显著SNP位点集中在第14号染色体上，形成了一个明显的关联热点区，提示该区域可能存在协调调控营养器官着色的遗传机制。
候选基因筛选与功能注释
以13个稳定SNP位点为基础，在其上下游区域内初步筛选出39个基因，经功能注释排除未知功能基因后，得到16个候选基因。KEGG富集分析显示，这些基因显著富集于“转录调控”和“脂肪酸生物合成”等通路。结合功能与表达分析，研究者重点关注了五个基因：VIT_14s0006g02210（DNA连接酶）、VIT_14s0083g01050（MADS-box蛋白2）、VIT_16s0039g01900（Myb-like结构域蛋白）、VIT_06s0004g03620（促分裂原活化蛋白激酶，MAPK）和VIT_06s0004g03640。
qRT-PCR（实时荧光定量PCR）分析
表达分析结果显示，VIT_14s0083g01050 (MADS-box蛋白2)、VIT_16s0039g01900 (Myb-like结构域蛋白) 和 VIT_06s0004g03620 (MAPK) 在叶片中表达量最高，且它们的表达水平在着色由浅至深的品种中呈现出一致的、逐渐升高的趋势。而VIT_14s0006g02210尽管在品种间表达与着色相关，但在目标叶片组织中表达量较低；VIT_06s0004g03640的表达则与着色变化无显著关联。因此，研究最终锁定上述三个基因（VIT_14s0083g01050、VIT_16s0039g01900、VIT_06s0004g03620）为调控葡萄营养器官着色的关键候选基因。
讨论
本研究发现第14号染色体的关联热点区，与已报道的葡萄果实着色QTL（数量性状位点）部分重叠，但独立于决定欧亚种葡萄果皮颜色的关键基因簇MYBA1/MYBA2（位于第2号染色体）。这揭示了营养器官与果实着色可能由不同的遗传位点控制，存在器官特异性调控。在候选基因中，VIT_16s0039g01900编码一个R2R3-MYB转录因子，该家族是植物类黄酮和花青素生物合成的核心调控因子。其表达模式与着色强度的强相关性，提示它可能通过参与经典的花青素调控网络MYB–bHLH–WD40复合体来发挥作用。VIT_14s0083g01050编码一个AGAMOUS-like MADS-box蛋白，属于SEPALLATA亚家族。在拟南芥、番茄等植物中，该家族基因可通过形成蛋白复合体或与MYB等转录因子互作来调控花青素合成基因表达，进而影响器官着色。VIT_06s0004g03620编码一个MAPK。MAPK级联信号通路是整合内外源信号调控花青素合成的保守枢纽。在拟南芥和苹果中，MPK4可通过磷酸化稳定MYB75/MYB1等转录因子来正调控花青素积累。因此，本研究发现的VIT_06s0004g03620可能通过类似的磷酸化修饰机制，参与调控葡萄营养器官的花青素合成。当然，这些基因的功能尚需通过转基因、基因编辑等实验进一步验证。此外，本研究也存在一定局限，例如未对花青素含量进行生化定量，且候选基因仅为关联和表达层面的证据，缺乏直接的功能验证。
结论
本研究通过GWAS成功解析了葡萄营养器官着色性状的遗传基础，鉴定出13个稳定的显著SNP位点，并筛选出三个表达与着色强度紧密相关的关键候选基因：VIT_14s0083g01050 (MADS-box蛋白2)、VIT_16s0039g01900 (Myb-like结构域蛋白，属于R2R3-MYB家族) 和 VIT_06s0004g03620 (MAPK)。这些基因分别涉及转录调控、MADS-box蛋白功能及MAPK信号转导，为理解葡萄营养器官着色的复杂分子网络提供了新线索。该研究不仅加深了对葡萄环境适应性与胁迫响应机制的认识，也为未来利用分子标记辅助选择培育具有特定观赏价值或增强抗逆性的葡萄新品种提供了宝贵的遗传资源和理论依据。
