《Journal of Apicultural Research》：Establishing reference values of amino acids and acylcarnitines from 16 species of stingless bees (Hymenoptera: Meliponini) from Mexico
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本综述通过串联质谱（MS/MS）对墨西哥特有的16种无刺蜂（Meliponini）的代谢物进行首次系统性分析，量化了12种氨基酸和28种酰基肉碱，并建立了物种特异性参考值。该研究为评估这些关键传粉昆虫的健康状况、监测其对环境压力的生理响应（如能量代谢变化）以及支持其保护与监测工作提供了宝贵的基线数据和代谢组学（Metabolomics）工具。
摘要
无刺蜂是热带和亚热带地区重要的传粉昆虫，全球超过500种，而美洲大陆拥有最丰富的多样性，墨西哥已记录46种。它们以其酿造的、因选择性授粉而具有显著药用价值的、密度较低的蜂蜜而闻名，在生态系统和农业中扮演着关键角色。本研究旨在通过基于串联质谱（MS/MS）的代谢组学，对墨西哥特有的16种无刺蜂的完整虫体进行分析，鉴定主要的氨基酸和酰基肉碱，以建立其参考代谢谱。结果量化了12种氨基酸和28种酰基肉碱，并进行了统计学和生物信息学分析，为每种物种建立了参考值。值得注意的是，丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG）、甘氨酸（GLY）、亮氨酸（LEU）、脯氨酸（PRO）和缬氨酸（VAL）的浓度较高，而甲硫氨酸（MET）、鸟氨酸（ORN）和酪氨酸（TYR）的含量较低。酰基肉碱谱显示，所有物种中游离肉碱（C0）和乙酰肉碱（C2）的水平都较高。了解无刺蜂的代谢谱对于评估其健康、检测潜在代谢变化至关重要。这项开创性研究为理解其对环境胁迫的生理响应提供了有价值的见解，有助于这些传粉昆虫的保护与监测。
引言
无刺蜂（Meliponini）是蜜蜂科（Apidae）下的一个族。它们在美洲拥有最大的多样性，在墨西哥，物种最多的州是恰帕斯和瓦哈卡。古代玛雅人在他们的法典中记录了无刺蜂养殖，突出了其社会和宗教意义。除了产蜜，这些蜜蜂是热带生态系统中关键的交叉传粉媒介，是比欧洲蜜蜂（Apis mellifera）更小、能通过振动（称为嗡嗡授粉）进行授粉的最主要本地蜂种。它们是多种需要振动授粉的花卉的重要传粉者，对咖啡、鳄梨、芒果、椰子等重要经济作物至关重要。然而，蜂群数量的减少已成为一个严峻问题。代谢组学方法自20世纪90年代以来在昆虫研究中得到发展，用于发现生物标志物、评估暴露于有毒物质的风险等。近年来，代谢组学技术的进步使得能够鉴定蜂蜜和蜂胶中的关键代谢物。了解无刺蜂物种的代谢变化对于评估其健康、确定可能的代谢变化以理解野生动物对环境的生理反应至关重要。本研究首次对墨西哥特有16种无刺蜂的游离氨基酸和酰基肉碱进行了代谢组学分析。
材料与方法
生物材料
在墨西哥不同州采集了16种无刺蜂（Meliponini）的成年工蜂。确保采集健康样本，蜂群有活动，工蜂进出蜂巢，且蜂巢位于未施用杀虫剂的农业生态管理区域。样本保存于DNA Shield中，并运输至实验室于-80 °C保存直至处理。
代谢物提取
每个物种取10只标本的三个重复，在500 μL ddH2O中均质化，离心后取上清液过滤，将30 μL滤液滴加到滤纸（S&S903）上。
代谢组学分析
使用串联质谱（LC-MS/MS）分析滤纸样品中的12种氨基酸和28种酰基肉碱。采用NeoBase非衍生化LC-MS/MS试剂盒，按照制造商说明操作。使用含稳定同位素标记内标的溶液定量目标代谢物。样本在LC-MS/MS系统上分析，使用多重反应监测（MRM）模式采集数据，并使用MassLynx软件和Chemoview数据库分析计算分析物浓度。
统计分析
数据在R语言中使用tidyverse套件进行分析。对于每类代谢物（氨基酸和酰基肉碱），原始浓度值首先转换为百分比。使用pheatmap包生成平均百分比组成的热图，通过欧几里得距离和完全连接法对代谢物和物种进行聚类。使用viridis调色板表示相对丰度。此外，对百分比归一化矩阵进行了有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以探索物种区分并识别驱动分离的代谢物。对所有归一化百分比数据进行后续统计分析，使用Kruskal-Wallis检验评估各代谢物在不同物种间的全局差异，并对多重比较进行Bonferroni校正。对Kruskal-Wallis检验中adj< 0.05的代谢物进行成对Dunn检验。
结果
无刺蜂物种间的氨基酸组成
通过串联质谱（MS/MS）定量分析了16种无刺蜂中12种游离氨基酸的相对丰度，其组成因物种和氨基酸类型而异。氨基酸谱显示所评估的12种代谢物的相对丰度存在种间差异。最丰富的氨基酸是丙氨酸（ALA），在Melipona fasciata中含量最高（55.7%），其次是Frieseomelitta nigra（55.4%）。最低的ALA浓度出现在Plebeia frontalis中（24.7%）。亮氨酸（LEU）在P. frontalis（21.7%）和Scaptotrigona hellwegeri（21.1%）中达到最高，而F. nigra的水平最低（4.0%）。脯氨酸（PRO）在F. nigra（21.8%）、M. fasciata（16.1%）和Trigona corvina（15.6%）中特别高。缬氨酸（VAL）在F. nigra（3.9%）和P. frontalis（13.3%）之间变化。甘氨酸（GLY）在Melipona beecheii（14.3%）和Melipona yucatanica（14.6%）中最为丰富，而F. nigra记录到最低值（4.1%）。精氨酸（ARG）变化很大，T. corvina的百分比最高（17.6%），Scaptotrigona pectoralis最低（3%）。甲硫氨酸（MET）在所有物种中含量都较低，范围从M. fasciata的0.01%到S. pectoralis的2.6%。苯丙氨酸（PHE）范围从1.4%（F. nigra）到5.9%（S. pectoralis），而酪氨酸（TYR）在T. corvina中最高（3.6%），在Cephalotrigona zexmeniae中最低（0.03%）。瓜氨酸（CIT）和鸟氨酸（ORN）通常比例较低。琥珀酰丙酮（SA）水平在所有物种中始终极低。
无刺蜂物种间的酰基肉碱谱
通过串联质谱（MS/MS）定量分析了16种无刺蜂中28种酰基肉碱的相对丰度。检测到的化合物包括短链、中链和长链酰基肉碱，其浓度在不同物种间存在显著变化。游离肉碱（C0）是所有物种中最丰富的酰基肉碱。最高的C0百分比出现在M. yucatanica中（91.8%），其次是Melipona solani（91.3%）、C. zexmeniae（90.5%）和P. frontalis（89.8%）。最低的C0浓度记录在T. corvina中（40.2%）。乙酰肉碱（C2）值在F. nigra（14.4%）、Trigona fulviventris（12.4%）、Partamona bilineata（11.9%）和Nannotrigona perilampoides（11.0%）中较高。相反，较低的C2百分比出现在M. solani（2.1%）和M. beecheii（2.9%）中。丁酰肉碱（C4）变化范围很广，在T. corvina中观察到的值最高（17.6%）。其他中链和长链酰基肉碱如C8、C10、C14和C16在所有物种中的百分比通常低于2%。羟基化和二羧酸形式，包括C6DC和C16OH，在如T. corvina和F. nigra等分类群中显示中等水平。
代谢物谱的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）
PLS-DA作为一种有监督的多变量方法，用于评估基于代谢物组成的物种分离，并识别对类别区分贡献最大的代谢物。对百分比归一化的氨基酸和酰基肉碱数据进行了组合PLS-DA，以可视化物种间的整体代谢变异。氨基酸的PLS-DA将物种沿前两个成分分开。成分1和成分2共同解释了总X方差的61.6%。沿成分1，P. frontalis、M. beecheii和S. pectoralis等分类群得分强阳性，而F. nigra和M. fasciata得分强阴性。沿成分2，T. corvina显示出最高的阳性得分。最具判别力的氨基酸是MET、TYR、PHE、PRO和ORN。在酰基肉碱中，最具判别力的酰基肉碱是C12:1、C16:1OH、C18、C14:2和C5。
氨基酸谱的多变量分析与成对比较
对Kruskal-Wallis检验结果显著（adj< 0.05）的氨基酸进行了Bonferroni校正的成对Dunn检验。对于ALA，在P. frontalis与T. corvina之间、S. hellwegeri与S. mexicana之间，以及最显著地在S. hellwegeri与T. corvina之间检测到显著差异。在ARG、CIT、GLY、LEU、MET、ORN、PHE、PRO、TYR和VAL等氨基酸中，也发现了多个物种间的显著差异对比。
酰基肉碱谱的多变量分析与成对比较
对Kruskal-Wallis检验结果显著（adj< 0.05）的酰基肉碱进行了Bonferroni校正的成对Dunn检验。游离肉碱（C0）在P. frontalis与T. corvina之间、S. hellwegeri与T. corvina之间显著不同。对于癸酰肉碱（C10）、单不饱和癸酰肉碱（C10:1）、十二酰肉碱（C12）、单不饱和十二酰肉碱（C12:1）、十四酰肉碱（C14）、十六酰肉碱（C16）、单不饱和十六酰肉碱（C16:1）、羟基化单不饱和十六酰肉碱（C16:1OH）、十八酰肉碱（C18）、羟基化十八酰肉碱（C18:1OH）、乙酰肉碱（C2）、丙酰肉碱（C3）、戊酰肉碱（C5）、单不饱和戊酰肉碱（C5:1）、己酰肉碱（C6）、二羧酸己酰肉碱（C6DC）和亚油酰肉碱（C8:1）等多种酰基肉碱，均在多个物种对之间发现了统计上显著的差异。
讨论
无刺蜂是自然和农业生态系统中重要的传粉者，因其生态作用和生产蜂蜜等蜂产品而受到重视。然而，包括无刺蜂在内的本地蜂群数量全球性下降已引起对其保护的关注。代谢组学已成为理解昆虫生理状态和胁迫反应的有前景的方法。本研究首次对墨西哥16种无刺蜂进行了代谢组学表征，旨在建立健康工蜂氨基酸和酰基肉碱的参考谱。以前的研究主要探索了A. mellifera和Bombus terrestris的代谢组学。在本研究中，我们发现丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸是所有无刺蜂物种中最丰富的氨基酸。相比之下，甲硫氨酸和鸟氨酸的含量始终较低。脯氨酸在所有分析的无刺蜂中的高丰度值得注意。脯氨酸在飞行期间的能量代谢中起作用，可作为抗冻保护剂，并有助于昆虫的渗透调节。丙氨酸也以高浓度出现，可能与脯氨酸一起参与飞行期间与能量相关的途径。甲硫氨酸虽然含量低，但是一种必需氨基酸，已知会影响A. mellifera的发育和免疫力。与氨基酸相比，文献中关于无刺蜂中酰基肉碱的讨论仍然有限。我们的分析显示所有物种中都存在短链酰基肉碱，游离肉碱和乙酰肉碱的相对丰度较高。这些化合物在脂肪酸运输和线粒体能量代谢中至关重要。长链酰基肉碱的相对稀少表明，采集时蜜蜂可能没有积极动员长链脂肪酸。饮食对氨基酸和酰基肉碱谱的影响在其他传粉者中已有报道。环境变量，如饮食、季节变化和温度，已知会影响蜜蜂的代谢组学谱。总的来说，我们的结果为墨西哥无刺蜂的代谢组学谱建立了一个基础数据集。未来的研究应旨在整合环境变量、生理状态和行为背景，以阐明这些生态重要昆虫的代谢适应。这些参考值代表健康个体，可作为未来健康监测的基线。需要与受胁迫或患病的蜜蜂进行比较研究，以定义诊断性的代谢组学变化。
结论
关于无刺蜂的研究传统上侧重于形态特征和生态作用。我们的代谢组学方法使用串联质谱（MS/MS），表征了16种无刺蜂物种的氨基酸和酰基肉碱谱，为未来的比较提供了基线数据。关键氨基酸和能量相关代谢物的一致存在表明无刺蜂之间存在保守的代谢功能。这项基础性工作支持开发用于监测无刺蜂健康和胁迫的代谢组学工具。需要进一步研究以更好地理解影响无刺蜂代谢物组成的环境、饮食和生理因素。
