利用核磁共振（NMR）技术研究RNA解旋酶DDX3X在单链RNA上的滑动运动

《Biophysical Chemistry》：NMR investigation of the sliding motion of RNA helicase DDX3X along single-stranded RNA

双链RNA解旋酶DDX3X的滑动动力学及非过程性解旋机制研究。通过溶液NMR监测发现，ATP结合状态下DDX3X沿单链RNA的滑动速率小于10 s?1，支持其通过局部链分离而非过程性滑动进行解旋。

　　

富山由纪|熊原正則|武内晃|岛田一夫

理研综合医学科学中心（RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, IMS），日本神奈川县横滨市鹤见区末広町1-7-22，邮编230-0045

摘要

核酸的结构形成与解旋酶蛋白之间的复杂相互作用是多种基本生物过程的基础。在这些解旋酶中，DDX3X是最著名的RNA解旋酶之一，参与多种生理功能，如基因表达的翻译调控。尽管许多结构和生化研究已经探讨了DDX3X如何将稳定的双链RNA（dsRNA）解旋为单链RNA（ssRNA），但其确切机制仍存在争议。一个关键问题是DDX3X是通过沿ssRNA移动或滑动来逐步解旋dsRNA，还是通过直接结合暴露的ssRNA片段来局部破坏dsRNA的稳定性。为了更深入地了解DDX3X的分子机制，我们使用溶液核磁共振（solution NMR）技术监测了其在由poly-C和poly-A片段组成的ssRNA上的滑动行为。随后，我们研究了DDX3X沿ssRNA滑动的速度，这是其逐步解旋机制的前提。我们的二维线形分析和ZZ交换实验表明，DDX3X沿ssRNA的滑动速度非常慢，最大滑动速率估计为10?s^?1或更低。这些发现支持了DDX3X通过优先结合ssRNA片段来局部分离链片段的模型，从而为其作为非逐步解旋酶的功能提供了分子层面的解释。

引言

许多生命过程通过核酸的结构形成与解旋酶蛋白之间的精细相互作用而得到精确调控。核酸解旋酶是一类能够通过ATP水解作用解开DNA和RNA的二级和三级结构并使其单链化的酶，从而参与复制、转录、翻译和剪接等关键生命过程[1]、[2]、[3]、[4]。DEAD-box RNA解旋酶（DDXs）是人类中最大的RNA解旋酶家族，在RNA代谢的几乎所有方面都起着关键作用[5]、[6]。在DDX解旋酶中，编码在X染色体上的DDX3X通过其RNA解旋活性参与特定基因组的翻译调控[7]、[8]。DDX3X的生理重要性体现在，影响其解旋功能的错义突变常与癌症和神经系统疾病等多种疾病相关[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。

鉴于其生理重要性，人们非常关注DDX3X如何解旋双链RNA（dsRNA）。其解旋机制已通过体外解旋酶活性测定[15]、[16]、[17]、[18]、X射线晶体学的高分辨率结构分析[19]、[20]以及单分子实验[22]、[23]、[24]得到了广泛研究。描述解旋酶分子机制的通用模型大致可分为两类：一类假设通过沿RNA链移动或滑动来逐步解旋dsRNA；另一类则认为通过优先结合或夹住从dsRNA中分离出的单链片段来实现局部解旋[3]、[5]、[25]、[26]（图1）。前者逐步解旋模型与广泛接受的“尺蠖模型”密切相关，即解旋酶蛋白沿dsRNA链的一条链进行一维移动并伴随ATP水解，从而导致双链分离。我们还考虑了一种更为被动的作用模式，即解旋酶通过捕获瞬时的碱基开放事件来滑动（图1a）。后者非逐步解旋模型提出，解旋酶蛋白通过优先结合从dsRNA自发分离或局部解旋产生的单链区域来破坏双链稳定性，这种机制有时被称为“局部链分离/解旋模型”或“不稳定模型”[4]、[16]、[26]、[27]（以下简称“局部链分离模型”）（图1b）。尽管这些机制并不互相排斥，但目前尚无共识哪种解旋机制最能准确描述DDX3X的功能。生化分析表明，DDX3X通常无法解旋长链dsRNA，且其解旋效率与双链稳定性呈负相关[18]，这与“局部链分离模型”一致。使用磁镊子的单分子实验也观察到酵母中的DDX3X类似物Ded1p缺乏逐步解旋能力[22]。然而，在与其密切相关的真核生物翻译起始因子4A（eIF4A，也称为DDX2）中，当eIF4A与伴侣蛋白eIF4G和eIF4H形成复合物时，观察到了逐步解旋现象[28]，这表明在某些情况下可能存在逐步解旋机制。对大肠杆菌中的DDX蛋白DbpA的原子力显微镜分析也表明，在其沿dsRNA移动过程中形成了特征性的Y形中间体，支持了尺蠖型逐步解旋酶机制[29]。其他相关的DEAH/RHA解旋酶家族成员（包括痘病毒NPH-II[30]和丙型肝炎病毒NS3解旋酶[31]）也被认为具有逐步解旋能力，这些解旋酶与DDX解旋酶具有结构相似性[4]、[32]、[33]。

研究解旋机制的一个根本难点在于解旋酶与DNA/RNA相互作用的高度动态性，这种动态性难以用传统结构技术捕捉。虽然单分子实验可以直接提供解旋过程的信息，但由于空间分辨率有限（通常在亚纳米级别），它们无法提供原子级别的信息，如构象变化或DNA/RNA相互作用模式的变化[34]。在这方面，溶液核磁共振（NMR）光谱技术能够补充这些方法，以接近原子级别的分辨率提供蛋白质动态的独特见解，使我们能够定量研究解旋酶蛋白如何沿DNA/RNA链滑动、它们的结合模式如何变化以及这些过程的发生速度。尽管NMR在解旋酶研究中的应用相对有限，但其这一独特特性已被巧妙地用于监测转录因子蛋白在双链DNA（dsDNA）上的滑动和跨片段转移，为这些转录因子如何高效寻找特定识别位点提供了机制解释[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]。

在这项研究中，我们利用溶液NMR的独特能力来研究DDX3X解旋酶核心的解旋机制。我们的主要关注点是解旋酶如何沿ssRNA链滑动，因为对这一过程的定量描述有助于判断是否存在逐步解旋行为，并为定义DDX3X的解旋机制提供直接证据。我们发现，在ATP结合状态下，DDX3X会形成稳定的DDX3X-ssRNA复合物，此时DDX3X要么不滑动，要么沿ssRNA链非常缓慢地滑动，根据二维信号线形分析和ZZ交换光谱分析，其滑动速率估计低于10?s^?1。我们的数据更符合“局部链分离模型”，这可能解释了其在RNA解旋过程中缺乏逐步解旋能力的原因。

蛋白质表达与纯化

人类DDX3X核心蛋白（残基132–607，UniProt: O00571）由Eurofins Genomics公司合成，并克隆到一个经过改造的pET28a(+)载体中，该载体包含T7pCONS启动子和翻译起始区域TIR-2[45]，以表达为N末端带有His₆-SUMO标签的融合蛋白。在标签和蛋白质之间插入了两个甘氨酸连接残基，以便于Ulp1蛋白酶切割。通过反向聚合酶链反应引入了E348Q突变，并通过测序进行了验证。

模型ssRNA的结合特性

DDX3X是一种包含662个残基的蛋白质，其解旋酶核心（残基132–607）由两个类似RecA的结构域D1和D2组成，ATP结合口袋位于D1结构域内。在之前的研究中[51]，我们表征了该解旋酶核心的RNA结合特性，发现其在ATP结合状态下优先结合ssRNA。图2a显示了含有E348Q突变的Metε-¹³C¹H₃-标记的DDX3X解旋酶核心的¹³C-¹H HMQC光谱中的甲硫氨酸区域。

讨论与结论

在这项研究中，我们探讨了ATP结合形式的DDX3X是否以某种方式沿ssRNA滑动，这种滑动行为是其逐步解旋能力的基础。我们利用了NMR的独特能力，即DDX3X的M352甲基探针可以区分接触的核碱基类型，从而直接监测DDX3X与ssRNA结合时的相对位置。通过详细分析，我们估算了在20-mer poly-C₁₀A₁₀链上Cyt-和Ade接触状态之间的滑动动力学。

作者贡献

Y.T.负责项目构思、执行EMSA结合实验、进行NMR线形模拟并分析NMR数据。Y.T.和M.K.负责蛋白质纯化、制备NMR样品并实施NMR实验。Y.T.、K.T.和I.S.共同设计了研究内容并撰写了论文。

作者贡献声明

富山由纪：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构思。熊原正則：研究实施、数据分析。武内晃：撰写 – 审稿与编辑、研究监督、资金获取。岛田一夫：撰写 – 审稿与编辑、研究监督、资金获取。

代码可用性

本研究中使用的Python脚本以及用于ZZ交换实验的Bruker格式脉冲序列可在https://github.com/YukiToyama/Sliding_motion_DDX3X/获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项工作得到了日本医学研究开发机构（AMED）（项目编号JP21ae0121028（针对I.S.）和JSPS KAKENHI（项目编号JP25K22521（针对K.T.）、JP25H02244（针对Y.T.）及JP24K09408（针对Y.T.）的资助。分子图形和数据分析使用了加州大学旧金山分校的生物计算、可视化和信息学资源开发的UCSF ChimeraX软件，该软件得到了美国国立卫生研究院（项目编号R01-GM129325）和网络办公室的支持。