硫化氢通过上调Isthmin 1基因的表达，抑制罗滕酮（rotenone）诱导的HT22细胞铁死亡（ferroptosis）过程

《Brain Research》：Hydrogen sulfide inhibits rotenone-induced ferroptosis of HT22 cells by upregulating Isthmin 1

H2S通过抑制ROT诱导的铁死亡保护海马神经元，机制涉及ISM1的上调。实验证实NaHS减少Fe2+积累和脂质过氧化，上调GPX4/FTH1，过表达ISM1可独立抑制铁死亡，揭示H2S-ISM1-铁死亡轴在神经保护中的作用。

　　

帅新燕|杜璐|魏海军|张萍|邹伟|唐晓晴

中南大学湘雅医学院附属南华医院神经内科，湖南衡阳421001

摘要

背景

硫化氢（H₂S）已被证实具有在帕金森病（PD）模型中的强效神经保护作用，但其背后的细胞和分子机制尚未完全阐明。铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁的调控性细胞死亡形式，越来越多地被认为与PD的发病机制有关。Isthmin 1（ISM1）是一种主要在大脑中表达的分泌蛋白，在神经保护和代谢调节中发挥着重要作用。本研究旨在探讨H₂S是否通过调节铁死亡来保护神经元免受罗通宁（ROT）的损伤，并探索ISM1在此过程中的潜在中介作用。

方法

HT22细胞在有无H₂S供体NaHS的情况下暴露于ROT。使用CCK-8试剂检测细胞活力，并通过透射电子显微镜（TEM）评估细胞形态。使用铁离子含量测定试剂盒测量细胞内的Fe²⁺。通过ELISA试剂盒检测丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）。利用流式细胞术检测细胞质和脂质活性氧（ROS）的产生。通过Western blot分析谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、铁蛋白重多肽1（FTH1）和长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）的蛋白水平。

结果

NaHS显著减轻了HT22细胞中的ROT诱导的铁死亡。这通过抑制线粒体损伤、减少Fe²⁺积累和脂质过氧化、上调铁死亡相关蛋白GPX4和FTH1以及下调ACSL4得到证实。NaHS还增加了ISM1的表达。重要的是，ISM1的过表达足以抑制ROT诱导的铁死亡和脂质过氧化。

结论

这些结果表明，H₂S至少部分通过上调ISM1来对抗海马神经元中的ROT诱导的铁死亡，揭示了H₂S-ISM1-铁死亡轴在神经保护中的作用。

引言

认知功能障碍是帕金森病（PD）的一种普遍且致残的非运动并发症，严重影响了患者的生活质量（Aarsland等人，2021年；Oedekoven等人，2022年）。目前，预防或逆转这种认知衰退的实际策略仍然缺乏（Weintraub等人，2022年），这突显了探索新治疗靶点的重要性。海马区对学习和记忆至关重要，是与PD相关的认知衰退的关键病理部位（Belloso-Iguerategui等人，2023年）。硫化氢（H₂S）作为一种关键的气态信号分子，已显示出广泛的神经保护作用（Zhang和Bian，2014年；Zhou和Tang，2011年）。越来越多的证据表明，H₂S对各种病理损伤引起的认知障碍具有保护作用（He等人，2019年；Kang等人，2021年），使其成为对抗PD痴呆的有希望的候选物质。同时，我们之前的研究已经证明H₂S通过减轻海马神经元损伤显著改善了认知缺陷（Huang等人，2025年）。然而，H₂S在PD认知功能障碍中对抗海马神经元损伤的精确细胞机制仍不清楚。

铁死亡是一种最近被发现的调控性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物的铁依赖性积累（Dixon等人，2012年；Yang和Stockwell，2016年）、线粒体功能障碍（Li等人，2023年）和膜破裂（Xie等人，2016年），最终导致细胞死亡。越来越多的证据表明铁死亡与PD的发病机制有关（Ding等人，2023年；Wang等人，2023年）。重要的是，这一过程与认知功能障碍密切相关（Ayton等人，2020年）。从机制上讲，神经元中的铁死亡会导致线粒体损伤和功能障碍，进而损害神经元功能，干扰突触传递，抑制神经递质的合成和释放，最终导致神经元死亡，从而引发认知缺陷（Zhang等人，2024年）。值得注意的是，海马神经元中的铁积累会直接触发铁死亡，导致显著的记忆障碍（Bao等人，2021年），这突显了其在认知衰退中的作用。此外，最近的研究表明H₂S可以减轻氧化应激（Kimura和Kimura，2004年），保持线粒体功能（Paul等人，2021年），并在多种疾病模型中抑制铁死亡（Wang等人，2021年）。因此，抑制海马神经元中的铁死亡为阐明H₂S对PD认知功能障碍的影响提供了一种新的方法。

铁死亡在认知衰退中的作用从根本上源于脂质代谢障碍和脂质过氧化物的失调（Ge等人，2026年）。鉴于海马区对学习和记忆至关重要，且特别容易受到氧化应激的影响（Maeda等人，2011年），识别能够稳定脂质稳态并提供神经保护的内源性因子对于开发PD的新治疗策略至关重要。已知脂联素这种脂肪因子可以调节脂质代谢（Pham和Park，2022年）和细胞内脂肪酸转运（Lin等人，2023年）。脂质代谢的失调会导致脂质过氧化和氧化应激，这是铁死亡的关键特征（Man等人，2022年）。Isthmin 1（ISM1）是一种主要在大脑中表达的分泌脂肪因子（Jiang等人，2021年；Pera等人，2002年），并参与神经发育（Osório等人，2014年）。脂肪因子瘦素在PD中具有神经营养和神经保护作用（Roseberry等人，2007年）。此外，研究发现H₂S可以增强瘦素对抗阿瑞可林（arecoline）诱导的神经毒性的作用（Cheng等人，2022年）。作为参与脂质代谢调节的分泌脂肪因子，ISM1可能通过影响脂质过氧化来调节铁死亡（Bozkurt和G?rücü Yílmaz，2023年）。基于这些观察，推测ISM1可能是H₂S抑制铁死亡的下游介质是合理的。

鉴于海马区在学习和记忆中的重要作用（Nakazawa等人，2004年；Wu等人，2002年），我们使用了HT22细胞（一种小鼠海马神经元细胞系），并将其暴露于ROT（一种广泛用于建立PD模型的神经毒素）。本研究旨在探讨H₂S对ROT诱导的神经元损伤的保护作用，并阐明其潜在机制，从而揭示H₂S可能对抗PD认知功能障碍的分子途径。我们的结果表明，H₂S供体NaHS不仅抑制了ROT诱导的铁死亡，还上调了海马HT22细胞中的ISM1表达。从机制上讲，ISM1的上调被认为是H₂S保护作用的关键介质，因为ISM1的过表达本身就足以减轻ROT诱导的铁死亡损伤。这些数据揭示了一个先前未被认识到的发现：通过上调ISM1来抑制铁死亡有助于H₂S介导的对ROT诱导的神经毒性的保护。因此，我们的工作将ISM1-铁死亡途径定义为H₂S对抗PD认知功能障碍的基本机制，使ISM1成为开发治疗PD认知衰退的新靶点。

材料

NaHS（产品编号#SHBG4251V）、ROT（产品编号#R8875-5G）、DMEM（产品编号#D5796）和Trypsin-EDTA溶液（产品编号#T4049）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。抗ISM1抗体（产品编号#YN4996）购自Immunoway（美国德克萨斯州普莱诺）。抗GPX4抗体（产品编号#sc-166570）和抗ACSL4抗体（产品编号#sc-365230）购自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。抗FTH1抗体（产品编号#4393）购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹弗斯）。GAPDH（产品编号#60004-1-Ig）...

ROT在HT22细胞中诱导铁死亡

为了研究ROT在HT22细胞中诱导的神经毒性中的铁死亡作用，我们评估了关键的铁死亡标志物，包括细胞内Fe²⁺水平、氧化应激指标、铁死亡相关蛋白的表达、细胞活力和线粒体形态。ROT处理（0.5、1和2 μM，24小时）显著下调了铁蛋白重多肽1（FTH1）的表达（图1A）并增加了细胞内Fe²⁺含量（图1B），表明铁稳态受到破坏...

讨论

本研究首次从铁死亡的角度系统评估了H₂S的神经保护作用，并进一步揭示了ISM1在此过程中的中介作用。本研究的主要发现如下：（1）ROT在HT22细胞中诱导了铁死亡，而H₂S处理可以抑制这种铁死亡；（2）H₂S上调了暴露于ROT的HT22细胞中ISM1的表达；（3）ISM1的过表达抑制了HT22细胞中的ROT诱导的铁死亡。

资助声明

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82271485）和湖南省研究生研究创新项目（项目编号CX20240847）的支持。

CRediT作者贡献声明

帅新燕：撰写——原始草稿，概念构思。杜璐：方法学，数据管理。魏海军：正式分析。张萍：实验研究。邹伟：监督，资源提供。唐晓晴：撰写——审稿与编辑，资金筹集。