西班牙与阿尔及利亚手工乳制品中的微生物宝库：蕴藏具有显著面筋降解活性的乳酸菌

《Applied Microbiology》：Microbial Reservoirs in Artisanal Dairy Products from Spain and Algeria Harbor Lactic Acid Bacteria with Significant Gluten-Degrading Activity Abdelhak Menasri, Rosario Lucas, Javier Rodríguez López, Antonio Gálvez, Ma José Grande and Rubén Pérez Pulido

本研究发现西班牙与阿尔及利亚的传统手工乳制品是富含具有面筋降解活性乳酸菌（LAB）的重要资源。研究采用孔扩散与点种法筛选，鉴定出乳植生乳杆菌（Lactiplantibacillus）等优势菌种，其胞内与细胞结合型蛋白酶可有效水解面筋。特别是阿尔及利亚样品（如开菲尔、Klila）中的菌株活性更强，揭示了地域发酵实践对微生物功能的影响，为开发辅助面筋降解的益生菌或食品发酵剂提供了有前景的候选菌株。

　　

1. 引言

乳糜泻（Celiac disease, CD）是一种慢性免疫介导的小肠疾病，由小麦、大麦和黑麦中的面筋蛋白引发。面筋因其富含脯氨酸和谷氨酰胺，能抵抗人体消化酶的完全水解，导致免疫原性肽在肠道中持续存在，进而触发炎症反应。目前唯一的治疗方法是严格的无麸质饮食（Gluten-free diet, GFD），但这面临诸多挑战。因此，开发补充或替代疗法，特别是在面筋肽到达小肠前将其酶解，成为极具前景的策略。乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）因其复杂的蛋白水解系统，特别是包含能够分解面筋关键结构的脯氨酸特异性肽酶，而被广泛研究。传统发酵乳制品，因其自发的发酵过程和多变的微生物环境，是筛选具有独特功能（如增强蛋白水解能力）的新型LAB的宝库。西班牙和阿尔及利亚拥有丰富的传统乳制品制作工艺，但两地在气候、饲养方式和发酵技术上存在差异，可能塑造了具有不同蛋白水解能力的LAB群落。本研究旨在从这两个地中海国家的传统乳制品中分离LAB，筛选其面筋降解潜力，并比较其功能与分类学特征。

2. 材料与方法

本研究从西班牙（n=14）和阿尔及利亚（n=13）的小规模生产商处共收集了27份手工乳制品样品。样品包括西班牙的多种奶酪以及阿尔及利亚的传统产品如Jben、Bouhaza奶酪、开菲尔等。从样品中分离LAB，并在MRS和Elliker琼脂上培养。通过两种互补的琼脂法筛选面筋降解活性：使用无细胞上清液（Cell-free supernatants, CFS）的孔扩散实验，用于检测胞外蛋白酶；以及使用活菌培养物的点种实验，用于检测胞外和细胞表面结合的蛋白酶活性。面筋琼脂含有0.8% (w/v) 的小麦面筋。活性菌株通过16S rRNA基因测序进行分子鉴定。对来自不同地理来源的菌株活性进行统计学比较。

3. 结果

3.1. 分离与面筋降解活性筛选

共获得123株推定的LAB分离株。筛选显示，40株（32.5%）在孔扩散实验中呈阳性，而点种实验检测到更多的阳性分离株，为67株（54.5%），表明细胞结合型酶有重要贡献。水解圈直径在6至16毫米之间。来自阿尔及利亚产品的分离株产生的平均水解圈直径显著大于西班牙分离株。活性最强的菌株与阿尔及利亚的开菲尔和Klila产品相关。

3.2. 面筋降解分离株的分子鉴定

对32株最具活性分离株的分子鉴定显示，在高度活性菌株中，乳植生乳杆菌属最为突出。40%被鉴定为乳植生乳杆菌（Lactiplantibacillus），25%为肠球菌（Enterococcus），15%为短乳杆菌（Levilactobacillus brevis），10%为明串珠菌（Leuconostoc），其余10%为乳球菌（Lactococcus）。

西班牙样品表现出显著的生物多样性，其中来自新鲜奶酪和绵羊奶奶酪的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株显示出最高的蛋白水解活性。阿尔及利亚样品则显示出围绕乳植生乳杆菌属的显著特化，特别是在开菲尔和辣味Bouhaza等传统发酵产品中表现出持续的活性。这种分布反映了风土条件和传统制造方法对具有差异化蛋白水解能力的微生物群落选择的影响。

4. 讨论

本研究表明，传统乳制品发酵，特别是来自阿尔及利亚的产品，是富含具有显著面筋降解潜力LAB的重要来源。点种实验的更高灵敏度（56.4%阳性 vs. 孔扩散实验的38.5%）强烈表明这些分离株的蛋白水解系统有重要贡献，可能归因于细胞壁结合蛋白酶的活性。活性最强的菌株主要与植物乳植生乳杆菌和戊糖乳植生乳杆菌相关，这与它们复杂的蛋白水解系统（包括对水解富含脯氨酸的面筋肽至关重要的脯氨酸特异性肽酶）的报道一致。阿尔及利亚分离株活性显著更强可能归因于多个因素。传统的阿尔及利亚产品如开菲尔和Klila是涉及LAB和酵母共生群落的复杂生态系统，这可能驱动了其增强蛋白水解能力的进化。原料乳微生物群、动物饮食以及阿尔及利亚独特自发发酵过程的差异，可能有助于选择蛋白水解活性更强的微生物组。

从应用角度来看，筛选出的乳植生乳杆菌菌株是开发用于生产“减麸质”发酵食品的辅助发酵剂的理想候选者。此外，其益生菌潜力可能通过解毒面筋和调节肠道免疫反应提供双重益处。然而，未来的工作必须在生理相关条件下验证其功效，表征水解产物并评估残留免疫原性。此类益生菌应用需要严格的体内安全性评估和临床验证。

5. 结论

本研究成功从西班牙和阿尔及利亚的手工乳制品中鉴定出一系列具有降解面筋能力的LAB。点种实验在检测此活性方面证明更敏感，突出了细胞结合酶的重要性。特别是来自阿尔及利亚开菲尔和Klila的植物乳植生乳杆菌和戊糖乳植生乳杆菌菌株表现出最高的降解潜力。这些发现凸显了传统食物生态系统作为具有独特功能特性微生物来源的价值。所筛选的菌株代表了为乳糜泻和其他面筋相关疾病患者开发新饮食策略的有前景的生物工具，尽管进一步的研究对于验证其在水解免疫原性表位方面的功效以及评估其在胃肠道条件下的安全性和活性至关重要。