皮层调节机制决定了枯草芽孢杆菌内孢子的紫外线C（UV-C）抵抗性和耐热性特性

《Food Research International》：Cortex modulation shapes UV-C and heat resistance properties of Bacillus cereus endospores

Bacillus cereus孢子通过pdaA基因相位变异增强UV-C抗性，但导致热抗性和存活率下降，经反复热应力筛选获得cwlD抑制突变体恢复部分特性，揭示孢子壁结构与抗性平衡机制。

　　

萨达娜·卡纳尔（Sadhana Khanal）|汤姆·东民·金（Tom Dongmin Kim）|大卫·波法姆（David Popham）|亚布拉姆·阿特森（Abram Aertsen）

比利时鲁汶大学（KU Leuven）生物科学工程学院微生物与分子系统系食品微生物学实验室

摘要

紫外线-C（UV-C）和热处理在食品加工中广泛用于卫生设计和消毒，但食源性病原体的细菌内孢子能够通过适应性进化削弱这些处理方法的效果。最近的研究表明，Bacillus cereus ATCC 14579可以通过其基因的相变轻松获得增强的孢子对UV-C的抵抗力。基因编码一种参与孢子皮层形成的N-乙酰胞壁酸脱乙酰酶。具体来说，开放阅读框的破坏（导致PdaA^OFF状态）会使孢子对UV-C的抵抗力显著增强，但热抵抗力降低，同时孢子的存活率也会下降。在本研究中，我们发现对PdaA^?状态的ATCC 14579孢子进行反复热处理后，会筛选出具有减弱的CwlD胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶变体，这些变体能够使孢子的存活率和热抵抗力恢复到野生型（即PdaA^ON）水平，同时仍保持略微提高的UV-C抵抗力。因此，我们的发现揭示了孢子皮层结构变化与B. cereus在加工压力下的存活能力之间的关联。

引言

紫外线-C在食品加工厂（Gayán等人，2013年）、饮用水处理设施（Bintsis等人，2000年）和医疗环境（Casini等人，2019年）中已被证明非常有效地消灭微生物。然而，由Bacilli和Clostridia物种形成的细菌内孢子不仅具有极高的热稳定性和化学稳定性，还具有显著的UV-C抵抗力（Nicholson等人，2000年；Setlow，2006年）。事实上，根据物种的不同，孢子对UV-C的抵抗力比其营养体形式高10到30倍（Setlow & Christie，2023年）。

孢子DNA的特殊光化学性质以及孢子特有的DNA修复系统被认为是孢子UV-C抵抗力的主要因素。孢子DNA的光化学性质受到三个关键因素的影响：（）吡啶-2,6-二羧酸（即二吡啶甲酸或DPA）的存在；（）孢子核心水分含量低；（）孢子DNA被α/β型小分子酸性蛋白（SASPs）饱和（Nicholson等人，2002年；Setlow & Li，2015年）。值得注意的是，DPA作为光敏剂或光保护剂的作用仍有争议（Dikec等人，2022年；Kim等人，2021年），而后两个因素的影响则更为明确。较低的孢子水分含量和SASPs被认为会导致染色体DNA发生构象变化，从而促进化学性质不同的孢子光产物（SP）的形成，而不是有害的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和6-4嘧啶-嘧啶酮光产物（64PP）的生成。然而，与低核心水分含量和DPA的存在相比，α/β型SASP与孢子DNA的结合被认为是形成SP的主要因素（Setlow & Li，2015年）。在孢子萌发过程中，产生的SP通过两种主要的修复机制进行修复：SP裂解酶修复机制和通用核苷酸切除修复（NER），从而有效恢复受损的DNA区域（Nicholson等人，2002年；Setlow & Li，2015年）。

尽管人们对孢子UV-C抵抗力的分子机制有了深入了解，但对于孢子形成细菌通过适应性进化进一步提高孢子UV-C抵抗力的能力和机制知之甚少。最近，我们团队进行的一项定向进化研究表明，Bacillus cereus ATCC 14579可以很容易地进化出显著增强的孢子UV-C抵抗力（Begyn等人，2020年；Kim等人，2024年）。进一步的研究发现，这种UV-C抗性表型是由ATCC 14579的基因的相变介导的，该基因编码一种参与孢子皮层肽聚糖修饰的N-乙酰胞壁酸脱乙酰酶（PdaA）。具体而言，CwlD（一种胞壁酰L-丙氨酸酰胺酶）从N-乙酰胞壁酸（NAM）残基上切割肽侧链，而PdaA随后对NAM残基进行脱乙酰化并形成δ-内酰胺环（Fukushima等人，2002年；Gilmore等人，2004年；Tobin等人，2023年；Kim等人，2023年）。基因的相变是由其开放阅读框中的两个短串联重复区域（STRs）促成的（Kim等人，2024年）。反复的UV-C处理选择了某些突变体，在这些突变体中，其中一个STR的重复序列扩展破坏了的开放阅读框（即PdaA^OFF状态）。有趣的是，PdaA^OFF状态的转变对孢子UV-C抵抗力的提升贡献大于从营养体细胞到孢子的实际转变（Kim等人，2024年）。然而，这种显著增强的孢子UV-C抵抗力伴随着热敏感性的降低和孢子存活率的下降（Begyn等人，2020年；Kim等人，2024年）。值得注意的是，由于这种串联重复序列扩展的可逆性，在没有UV-C处理的情况下，孢子会自然恢复到PdaA^ON状态，此时孢子的存活率和热抵抗力完全恢复（Kim等人，2024年）。PdaA在孢子UV-C抵抗力中的意外作用以及这种抵抗力是以其他特性为代价的，这表明我们对孢子内部的结构-抵抗力关系理解还不够充分。

重要的是，UV-C处理还可能选择出与STR无关的功能丧失突变，这些突变是不可逆的（Kim等人，2024年）。因此，本研究探讨了这类UV-C抗性B. cereus突变体是否以及如何能够克服其PdaA受损状态带来的严重trade-offs。出乎意料的是，研究发现cwlD基因中出现了抑制突变，这些突变在很大程度上恢复了孢子的存活率和热抵抗力，同时仍保留了部分UV-C抵抗力。我们的发现强调了孢子皮层结构在调节B. cereus的UV-C和热抵抗力中的关键作用。

章节片段

菌株、培养基和培养条件

本研究使用的所有菌株均列在补充表1中。所有Bacillus cereus菌株在30°C的Brain Heart Infusion（BHI）培养基（Oxoid，英国巴斯汀斯托克）中培养，而用于所有克隆步骤的Escherichia coli DH5α则在37°C的Lysogeny broth（LB）培养基（Bertani 2004）（Oxoid）中培养。必要时，培养基会添加抗生素，最终浓度如下：E. coli添加氨苄西林100 μg/ml，B. cereus添加卡那霉素20 μg/ml。

热循环部分使C1和ΔpdaA恢复到野生型表型

由于PdaA^OFF状态的ATCC 14579突变体会在孢子存活率和热抵抗力下降的情况下获得UV-C抵抗力，我们想知道是否以及如何通过进一步进化来缓解这些PdaA^OFF状态带来的trade-offs。由于某些等位基因由于短串联重复序列的变化导致PdaA^OFF状态的可逆性（Kim等人，2024年），我们选择了使用ATCC 14579 C1突变体（该突变体的表达受到抑制）。

讨论

我们之前的研究表明，ATCC 14579的基因是一个应急位点，其中包含短串联重复区域，这些区域的扩展或收缩可以轻易破坏或恢复的阅读框，从而使细胞在PdaA^OFF和PdaA^ON状态之间切换（Kim等人，2024年）。虽然PdaA^OFF状态使孢子对UV-C的抵抗力显著增强，但也伴随着孢子存活率大幅下降和热抵抗力减弱等trade-offs。

CRediT作者贡献声明

萨达娜·卡纳尔（Sadhana Khanal）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，实验研究，数据分析，概念构建。汤姆·东民·金（Tom Dongmin Kim）：方法学设计，实验研究，数据分析，概念构建。大卫·波法姆（David Popham）：撰写——审稿与编辑，方法学设计，数据分析。亚布拉姆·阿特森（Abram Aertsen）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，实验研究，资金筹集，概念构建。

资金来源

本研究得到了弗兰德斯研究基金会（FWO-Vlaanderen）的资助（项目编号G0B5616N）和鲁汶大学研究基金（DBOF/14/049）的资助。

未引用的参考文献

Meador-Parton和Popham，2000年

Popham和Bernhards，2016年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Chris Michiels的宝贵意见。