开发可扩展生产的pH响应性自组装肽（源自Azumapecten farreri），用于促进疤痕减少的伤口修复

《Food Research International》：Engineering scalable production of pH-responsive self-assembling Azumapecten farreri-derived peptides for reduced-scarring wound repair

pH响应自组装多肽通过中性蛋白酶水解扇贝肌肉蛋白可控制备，在体外展现抗氧化、促凝血和促增殖活性，体内实验证实其可加速小鼠全层创面愈合、减轻炎症浸润及瘢痕残留，并维持口服给药后肠道菌群稳态。本研究提出食品级多肽作为新型生物材料的开发策略。

　　

作者：杨法明 | 吴学汉 | 牛彦祥 | 朱翔 | 刘文 | 陈立琦 | 孙轩 | 陈敬迪

山东大学海洋学院，中国威海 264209

摘要

源自食品的自组装肽具有多种生物活性，可用于组织修复，但其在生物医学领域的应用仍需进一步探索。本文报道了一种可扩展且可控的酶促富集工艺，通过中性蛋白酶水解从Azumapecten farreri中制备出pH响应型自组装肽（ANPs）。关键在于，pH响应性为ANPs的组装路径提供了可调控的手段：通过改变质子化状态，可以调节静电相互作用与疏水/π–π相互作用之间的平衡，从而在生理相关的pH范围内调整界面性质和纳米结构形态。这种可编程的组装机制赋予了ANPs多种生物活性：在体外实验中，它们表现出抗氧化、促凝血和促进细胞增殖的效果。在小鼠全层伤口模型中，无论是局部使用还是口服给药，ANPs均能加速伤口愈合，减轻炎症浸润，并促进疤痕形成减少，同时胶原I/III的比例符合再生重塑的特征；口服给药还显著维持了肠道微生物群的稳态。本研究为Azumapecten farreri资源的增值利用提供了一种新策略，并为减少疤痕的伤口愈合提供了一种具有临床前景的新材料。

引言

人工合成的自组装肽材料在组织工程领域受到了广泛关注，因为其序列可以精确设计，且可以通过调节疏水性、电荷分布和二级结构来促进有序组装（Chen & Zou, 2019; Guan et al., 2022; Zhou et al., 2023）。除了序列设计外，肽的自组装还受到电荷调控的显著影响：在聚集过程中，局部静电作用会改变质子化平衡和表观pK_a值，从而调节净电荷、氢键形成以及纤维/凝胶的形成（Gentile et al., 2025）。在含有组氨酸的系统中，脱质子驱动的pH切换可以触发纤维化并形成具有β-折叠特征的氢凝胶（Hesser et al., 2021）。其他肽材料则通过不同的主导相互作用进行组装，包括干式疏水/芳香堆积（Bera et al., 2019）或水合作用介导的稳定（Guo et al., 2021）。这些材料可以模拟细胞外基质（ECM），但成本、复杂性和规模化生产仍存在挑战，单一序列设计可能限制其在伤口修复中的多功能性（Deng et al., 2022; Guan et al., 2022; Vahedifar & Wu, 2022）。

相比之下，通过酶促水解制备的源自食品的自组装肽兼具多种生物活性、良好的生物相容性和经济可行性（Li et al., 2023; Vahedifar & Wu, 2022）。研究表明，这些肽不仅具有自组装能力，还表现出多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、保护肝脏和抗炎作用。尽管这些肽已在食品和化妆品领域得到广泛应用，但在生物医学领域的探索仍有限（Chen et al., 2022; Zhu et al., 2024）。此外，海洋生物是天然生物活性肽的丰富来源，海洋来源的自组装肽具有优异的功能活性，对人类健康非常有益，使其成为开发新型生物材料的理想候选者（Xu, Li, et al., 2024）。值得注意的是，Azumapecten farreri的肌肉蛋白是潜在生物活性肽的丰富来源，使其成为制备源自食品的自组装生物材料的理想选择（Wu, Wu, et al., 2024）。

无疤痕愈合/减少疤痕的伤口修复是理想的愈合目标，它强调减少炎症、促进血管生成、保持I型和III型胶原的平衡沉积，并恢复组织的天然结构以实现无疤痕的再生效果（Keane et al., 2018）。然而，目前的伤口敷料和支架通常只能支持伤口愈合的特定阶段，无法满足愈合过程的多维度需求（Norahan et al., 2023）。此外，许多传统材料在调节炎症反应和平衡胶原沉积方面存在不足（Yang et al., 2024）。在这种背景下，具有多种生物活性的自组装肽材料成为研究热点（Yang, Zhao, et al., 2022; Yang, Wang, et al., 2022）。特别是，pH响应性可以通过调节质子化/电荷来调控肽的组装，从而改变静电相互作用与疏水/π–π相互作用，最终改变二级结构、界面性质和组装形态——这些特性与动态的伤口微环境密切相关（Qin et al., 2024）。这些肽可以在伤口愈合的多个阶段提供全面的生物活性，如抗氧化、抗炎、止血和ECM重塑。这种pH可调的组装方式也有利于口服给药，因为胃肠道的pH梯度可以提高稳定性并实现定位释放（Li et al., 2022）。无疤痕愈合模型为验证源自食品的自组装肽的多功能性和生物医学潜力提供了理想平台。

因此，受到材料科学中的“一锅法”（Yang, Zhao, et al., 2022）和随机肽自组装方法（Votaw et al., 2021）的启发，我们利用一种可扩展的工程生产流程，从Azumapecten farreri中制备出了pH响应型自组装肽（ANPs）。该流程结合了可控的酶促肽富集（CEEP）技术，实现了高效且可扩展的肽合成。我们假设序列多样性和β-折叠驱动的组装共同调节了炎症、血管生成和I型/III型胶原的重塑，有利于实现无疤痕修复。据此，我们（i）使用CEEP结合LC–MS/MS和分子动力学技术确定了易于组装的序列和相互作用；（ii）验证了其在体外具有抗氧化、促凝血和促进细胞增殖的作用；（iii）在小鼠全层伤口模型中展示了局部和口服给药的效果——为多功能、源自食品的肽生物材料提供了可扩展的制备途径。

材料与方法

本文中使用的ANPs的材料、制备方法、物理化学表征及其他测试在补充材料中有详细描述。为确保可重复性和可扩展性，ANPs制备的关键工艺参数和过程控制/质量指标在表1中进行了总结。

ANPs的表征分析

如图S1a所示，LC–MS检测到了413种肽（分子量540–2800 Da；长度5–17个氨基酸），其中特征序列主要集中在770–1274 Da（长度7–15个氨基酸，表S2）；两种独立制备的肽的LC–MS/MS分布几乎相同（中位数8个氨基酸；分子量946–1083 Da），并且<3 kDa范围内的肽得到了高度富集（计数占比≥98.9%；面积占比≥99.9%），同时保持了相似的疏水/芳香残基含量（分别为43.0–48.2%和6.87–8.85%）（表S3），证明了批次间的稳定性。

讨论

本研究通过创新的、可扩展的集成工艺，利用可控的酶促水解和膜分离技术，成功从Azumapecten farreri中稳定制备出了pH响应型自组装肽材料（ANPs）（表1）。与具有确定折叠路径的单个合成肽不同，ANPs的固有序列多样性（表现为疏水性、电荷和二级结构倾向的异质分布）使其具有更复杂的组装特性。

结论

我们开发了一种清洁、可扩展的方法，从Azumapecten farreri中制备出pH响应型自组装肽，并在体外和体内验证了它们的多种促愈合作用，这些作用与无疤痕修复的特征一致。机制分析表明，组装过程中涉及疏水/π–π相互作用和氢键网络，且口服给药对肠道微生物群的影响最小。这些发现表明，源自食品的自组装肽是一种实用的生物材料。

作者贡献声明

杨法明：撰写 – 审稿与编辑，撰写初稿，数据可视化，方法学设计，实验设计，数据分析，概念构思。吴学汉：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，实验设计，数据管理。牛彦祥：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，实验设计，数据管理。朱翔：数据可视化，方法学设计，数据管理。刘文：数据可视化，数据管理。陈立琦：数据可视化，数据管理。孙轩：撰写 – 审稿与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2023MC125）和山东省海洋水产养殖创新与创业联盟项目（YZ2024007）的支持。本工作还得到了山东大学威海分校物理化学材料分析与测试中心以及海洋学院、生命与环境科学核心设施（微生物技术国家重点实验室和环境科学与工程学院）的支持。