一种基于明胶的炎症响应性水凝胶，其中负载了来自菊花的外泌体，通过调节巨噬细胞的极化作用，增强了神经损伤的修复并减轻了神经性疼痛

《International Journal of Biological Macromolecules》：An inflammation-responsive hydrogel based on gelatin, loaded with chrysanthemum-derived exosomes, enhances nerve injury repair and mitigates neuropathic pain through the modulation of macrophage polarization

糖尿病周围神经损伤的智能水凝胶疗法：基于硼酸修饰明胶-聚乙烯醇复合凝胶负载菊花外泌体的系统可响应炎症微环境（pH和ROS），通过调控巨噬细胞向修复性M2表型转化，促进神经纤维和髓鞘再生，改善运动功能（SFI恢复至-23.8），并显著提高痛觉阈值（PWT达53.1g），有效缓解神经性疼痛。

　　

钟伟龙|艾志刚|李行民|朱斌斌|陈晓敏|彭银丽

中山大学第三附属医院麻醉科，中国广东省广州市510630

摘要

周围神经损伤（PNI）可能导致运动功能丧失和炎症性疼痛，尤其是在糖尿病患者中。在这项研究中，我们开发了一种智能水凝胶（GBPVA），它能够响应炎症刺激，由硼酸改性的明胶（GelBA）和聚乙烯醇（PVA）组成，并负载了来自菊花的外泌体（Exos）。这种水凝胶具有炎症响应性，可以在炎症微环境中快速释放外泌体，调节巨噬细胞的极化，促进巨噬细胞向再生型M2表型转变，从而减轻炎症反应，促进神经修复并缓解神经病理性疼痛。体外实验表明，GBPVA/Exos具有优异的机械性能、自愈能力、强组织粘附性（对猪皮肤的粘附强度高达41.92 kPa）和生物相容性，支持神经元和施万细胞的粘附、迁移和轴突生长。体内动物模型显示，这种水凝胶显著抑制了炎症反应，促进了神经纤维和髓鞘的再生，改善了运动功能（GBPVA/Exos治疗4周后，坐骨神经功能指数（SFI）恢复到-23.8），减少了肌肉萎缩，并有效缓解了糖尿病相关的神经病理性疼痛（GBPVA/Exos治疗后，大鼠的爪子撤回阈值（PWT）增加到约53.1 g，接近PNI前的基线水平（约55.0 g）。此外，热撤回潜伏期（TWL）从13.4秒增加到14.7秒）。这种多功能水凝胶结合了天然植物来源的外泌体和智能材料，为糖尿病周围神经损伤的治疗提供了一种新策略。

引言

周围神经损伤（PNI）的治疗和功能恢复长期以来一直对临床医生构成重大挑战[1]、[2]、[3]。这主要是由于PNI的复杂病理生理学以及有效治疗方式的有限性。在糖尿病患者中，持续的高血糖水平、持续的胰岛素抵抗和微血管并发症共同加剧了节段性轴突脱髓鞘[4]、[5]、[6]。这些病理因素不仅阻碍了受损周围神经的再生，还可能导致肌肉萎缩。因此，糖尿病患者的周围神经修复变得更加复杂和困难。此外，神经损伤引起的炎症可能导致持续的神经病理性疼痛[7]、[8]。目前，临床实践中常用的神经缝合和神经移植方法[1]、[9]、[10]往往效果有限，存在供体部位并发症、免疫排斥和不良全身效应[11]、[12]。因此，迫切需要创新的治疗策略，以有效促进神经再生并同时缓解炎症驱动的神经病理性疼痛。

巨噬细胞在炎症反应和神经再生过程中起着关键作用，其表型可塑性影响组织修复的结果[13]、[14]、[15]。巨噬细胞表现出两种主要的极化状态，每种状态具有不同的功能。M1巨噬细胞促进炎症和碎片清除[16]，而M2巨噬细胞则促进组织修复、髓鞘再生和神经再生[15]、[17]、[18]。因此，在炎症阶段精确调节巨噬细胞的极化对于优化神经修复至关重要。响应性水凝胶可以根据微环境信号（如pH值和活性氧（ROS）调节其物理化学性质，从而为动态调节炎症提供了一个有前景的平台[19]、[20]、[21]。这些对pH值和ROS敏感的水凝胶可以增强靶向药物递送，为巨噬细胞表型转化创造有利条件，从而促进神经修复并缓解神经病理性疼痛。

植物来源的外泌体作为一种新型介质，最近因其天然来源、优异的生物相容性和运输生物活性分子的能力而受到关注[22]、[23]、[24]、[25]。菊花是一种传统的药用植物，以其抗炎和抗氧化特性而闻名，并已被证明可以缓解炎症反应[26]、[27]。菊花外泌体在调节炎症反应、促进组织再生和缓解神经损伤引起的神经病理性疼痛方面显示出相当大的潜力。通过菊花外泌体调节巨噬细胞表型可能为增强周围神经修复和减轻神经病理性疼痛提供一种天然且有效的方法。然而，外泌体在体内的快速释放和固有的不稳定性限制了其提供持续治疗效果的能力[28]、[29]。将外泌体结合到炎症响应性水凝胶中可以实现外泌体的可控释放，预计将产生持久的治疗效果[30]、[31]。

为了克服外泌体的不稳定性和不可控的药代动力学，提出了外泌体-水凝胶复合系统作为局部保留和可控释放的有前景策略。这些复合系统通常使用哺乳动物细胞来源的外泌体（如间充质干细胞和脂肪来源的基质细胞）结合到水凝胶中。尽管这些方法改善了局部外泌体的保留并促进了组织再生，但在糖尿病周围神经损伤（PNI）修复的背景下仍需解决几个关键挑战。这些挑战包括：(i) 开发一种专门针对糖尿病神经的炎症微环境（低pH值和高活性氧水平）的炎症响应性外泌体-水凝胶系统；(ii) 使用植物来源的外泌体同时调节巨噬细胞极化、支持神经元功能和缓解神经病理性疼痛；(iii) 具有足够的粘附性和可注射性，以便于组织植入和持续的治疗效果。

在这项研究中，我们开发了一种智能响应性水凝胶（GBPVA），由苯硼酸改性的明胶（GelBA）和聚乙烯醇（PVA）组成，并将菊花来源的外泌体封装在水凝胶中，形成了GBPVA/Exos。由于动态硼酸酯键的快速形成，这种水凝胶具有pH值和ROS响应特性。此外，GBPVA/Exos具有优异的机械性能、自愈能力、粘附性能和生物相容性。该系统可以通过炎症刺激激活，可控地释放菊花来源的外泌体，动态调节炎症微环境，促进巨噬细胞向修复型M2表型转变，增强神经再生，并有效缓解神经病理性疼痛。这种创新方法结合了天然植物外泌体和智能生物材料，为糖尿病周围神经损伤的治疗提供了一种有前景的治疗策略。

材料

明胶（Gel）、3-羧基苯硼酸（3-羧基-BA）、聚乙烯醇（PVA）、2-(N-morpholino)乙磺酸（MES）缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）均购自Macklin（中国上海）。除非另有说明，本研究中使用的其他化学试剂均购自Aladdin Reagent（中国上海）。

GelBA的合成与表征

总共8克明胶完全溶解在800毫升MES缓冲液中

GBPVA/Exos的制备与表征

图1显示，当将从菊花中分离出的外泌体混合到GelBA和PVA溶液中时，将pH值调整至8.0，并通过形成硼酸酯键完成交联，得到GBPVA/Exos。GBPVA/Exos可以注射到患有坐骨神经损伤的大鼠的伤口中。通过响应炎症释放外泌体，它可以调节巨噬细胞的表型，建立有利于神经再生的炎症微环境，促进神经再生

结论

与其他炎症响应性或基于外泌体的系统相比，本研究开发了一种炎症响应性水凝胶（GBPVA/Exos），其中包含菊花来源的植物外泌体作为生物活性载体。由于该水凝胶具有强组织粘附性，可以稳定地保留在损伤部位，实现连续的局部治疗。外泌体在炎症微环境（低pH值和高ROS）的刺激下以可控方式释放，从而调节巨噬细胞

CRediT作者贡献声明

钟伟龙：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据管理、概念化。艾志刚：监督、正式分析、概念化。李行民：验证、资源、方法学、正式分析。朱斌斌：验证、资源。陈晓敏：撰写——审阅与编辑、可视化。彭银丽：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念化。

伦理批准

所有动物实验均获得了深圳市凌福拓普生物技术有限公司实验室动物管理和使用委员会的批准（批准编号TOP-IACUC-2024-3247）。所有实验程序均按照《实验室动物护理和使用指南》进行。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：81372584）的支持。