《Acta Pharmaceutica Sinica B》：A new approach to discovering a broad-spectrum anti-respiratory virus drug: Tubeimoside II modulates host factor PACT to potentiate the RIG-I antiviral pathway
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为解决广谱抗呼吸道病毒药物缺乏的难题，研究人员以宿主靶点PACT/PRKRA为切入点，开展了天然产物筛选与机制研究。他们从传统中药中筛选出与PACT高亲和力结合的先导化合物Tubeimoside II (TBM II)，证实其可靶向PACT，激活下游RIG-I/MAVS/IRF3信号通路，促进I型干扰素IFN-β分泌，从而在体内外有效抑制冠状病毒(HCoV-OC43、SARS-CoV-2)和甲型流感病毒(IAV-H1N1)等多种呼吸道病毒，为开发基于宿主靶点的新一代广谱抗病毒药物提供了新策略。
流感、感冒、新冠肺炎……当各种呼吸道病毒轮番登场，对人类健康构成持续威胁时，我们手中的“武器”却常常显得捉襟见肘。现有的抗病毒药物大多“专药专治”，只针对某一种病毒，面对不断变异的新毒株和可能出现的全新病原体，其局限性日益凸显。更棘手的是，病毒也在不断“进化”，对直接针对其自身蛋白的药物产生耐药性，让治疗效果大打折扣。那么，是否存在一种“以不变应万变”的策略，通过增强人体自身的防御系统，来对抗多种不同的病毒呢？这正是“宿主靶向抗病毒(HTA)”策略的核心思路。相较于追着千变万化的病毒跑，直接靶向那些病毒赖以生存和复制的宿主细胞因子，理论上能够实现更广谱、更持久的抗病毒效果。在众多潜在的宿主靶点中，一个名为PACT (PKR activating protein，也称为PRKRA)的蛋白近年来脱颖而出。它像一位细胞内的“哨兵”，能够识别病毒入侵时产生的双链RNA，进而激活重要的抗病毒免疫通路——RIG-I信号通路，最终促使细胞分泌I型干扰素(IFN-I)，拉起一道抗病毒的“警报防线”。尽管PACT作为抗病毒靶点的潜力巨大，但此前尚未有能够特异性结合并激活它的药物分子（配体化合物）被发现。与此同时，具有多成分、多靶点特点的传统中药(TCM)化合物，在调节宿主免疫、对抗病毒感染方面展现出独特优势。将传统中药的宝库与前沿的宿主靶点研究相结合，能否碰撞出新的火花？发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上的这项研究给出了肯定的答案。研究人员在天然产物库中展开大海捞针般的筛选，最终锁定了一个源自传统中药土贝母的化合物——Tubeimoside II (TBM II，土贝母苷II)。研究发现，TBM II能够像一把精准的“钥匙”，插入PACT蛋白上的一个特定位点（Thr78），并稳定地与PACT结合。这种结合并非终点，而是一系列抗病毒反应的起点。TBM II通过结合PACT，促进了PACT与另一个关键“哨兵”蛋白RIG-I的“握手”合作，从而激活了RIG-I→MAVS→IRF3的信号传递链条。这条通路一旦被充分激活，细胞就会大量分泌I型干扰素，尤其是IFN-β，显著增强宿主的先天免疫应答，从而在病毒感染的早期阶段就构筑起坚固的防御工事。这项研究不仅首次报道了靶向PACT的配体化合物，也为我们利用宿主自身力量对抗多种呼吸道病毒，开发新一代广谱抗病毒药物，开辟了一条充满希望的新路径。
为了验证TBM II的抗病毒效果与机制，研究人员综合运用了多种体外、体内实验模型和技术手段。体外研究使用了人源细胞系（如Caco-2-N、A549、RAW264.7）以及可模拟SARS-CoV-2感染和复制的病毒样颗粒(trVLP)系统。体内研究则建立了小鼠感染模型，分别用甲型流感病毒IAV-H1N1/FM1和人冠状病毒HCoV-OC43经鼻感染ICR和BALB/c小鼠。在机制探索层面，研究采用了虚拟筛选与分子对接进行先导化合物预测；通过药物亲和靶点稳定性(DARTS)、细胞热位移分析(CETSA)、表面等离子体共振(SPR)和微量热泳动(MST)等技术，从多个角度证实了TBM II与PACT蛋白的高亲和力、特异性结合。利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术全景式解析了病毒感染及给药后小鼠肺组织的细胞与基因表达变化。此外，还通过基因敲低、过表达以及利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I、MAVS、IFN-β基因敲除细胞系，在分子和细胞水平上明确了PACT及RIG-I信号通路在TBM II发挥抗病毒效应中的决定性作用。
1. 高通量筛选鉴定靶向PACT的中药化合物
研究人员首先通过虚拟筛选，从化合物库中找到了10个与PACT潜在结合能较高的化合物，其中土贝母苷II(TBM II)在后续利用SARS-CoV-2 trVLP系统进行的抗病毒活性验证中表现突出，其对病毒荧光信号（GFP）的抑制效果与阳性药阿兹夫定(FNC)相近，且能降低SARS-CoV-2、HCoV-OC43和IAV-H1N1/FM1在多种细胞中的病毒载量，显示出广谱抗呼吸道病毒活性。
2. TBM II与PACT呈高亲和力结合
通过TBM II介导的Pull-down、DARTS、CETSA、SPR及MST等一系列靶点验证实验，研究证实TBM II能特异性且稳定地与PACT蛋白结合，其解离常数(Kd)为5.37 μmol/L。分子对接与点突变实验进一步将关键结合位点锁定在PACT蛋白的第78位苏氨酸(Thr78)上，该位点突变(Thr78Ala)会显著削弱TBM II与PACT的结合。
3. TBM II在体内对呼吸道病毒具有抗病毒保护作用
在IAV-H1N1/FM1和HCoV-OC43病毒感染的小鼠模型中，灌胃给予TBM II治疗5天。结果显示，TBM II能剂量依赖性地减轻病毒感染引起的肺部体积扩张和磨玻璃样病变（通过Micro-CT观察），显著降低肺组织中的病毒载量，并能逆转病毒感染导致的血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞比例下降，初步提示其通过增强宿主免疫发挥保护作用。
4. TBM II缓解呼吸道病毒诱导的肺部炎症
组织病理学(H&E染色)分析表明，TBM II治疗能显著减轻病毒感染引起的肺泡壁增厚、炎性细胞浸润等肺部病理损伤，降低肺指数。液相芯片(Luminex)检测发现，TBM II能降低感染肺组织中升高的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平。此外，对于可侵袭大脑的HCoV-OC43，TBM II也能降低脑组织病毒载量并改善神经病理改变。
5. TBM II主要影响流感病毒感染后肺中巨噬细胞和上皮细胞的基因表达
通过对病毒感染小鼠肺组织进行单细胞RNA测序，鉴定出13种主要细胞类型。分析发现病毒基因主要富集于巨噬细胞和上皮细胞中，而TBM II处理引起差异基因表达最显著的也正是这两种细胞，说明它们是TBM II在肺组织中发挥作用的主要靶细胞。
6. TBM II与PACT和RIG-I信号轴密切相关
单细胞测序的深入分析显示，病毒感染会上调促炎因子IL-1β和IL-6，下调抗炎因子IL-10，并减弱I型干扰素信号通路和RIG-I介导的信号级联。而TBM II处理能上调巨噬细胞和上皮细胞中Prkra (PACT的基因名)、Rigi、Mavs、Irf3等RIG-I通路相关基因的表达。MST和免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步证实，TBM II能增强PACT与RIG-I蛋白CTD结构域之间的相互作用。
7. TBM II通过RIG-I信号通路调节病毒感染小鼠的免疫应答
动态时序分析显示，病毒感染后肺组织中PACT、RIG-I和IFN-β蛋白表达呈先升高后降低的双相变化模式，而病毒载量持续上升。TBM II治疗能逆转这一趋势，通过免疫荧光和蛋白质印迹(Western blot)证实，其可显著提升感染肺组织中PACT、RIG-I、MAVS、IFN-β蛋白水平及IRF3的磷酸化水平，并上调Rigi和Ifnb1的mRNA水平，表明TBM II通过激活RIG-I→MAVS→IRF3轴促进IFN-β产生。
8. PACT是TBM II体外抗病毒效力的决定性因素
在细胞水平敲低PACT表达后，TBM II抑制病毒复制、降低炎性细胞因子IL-6和IFN-γ表达、减轻细胞病变效应以及上调RIG-I通路相关蛋白的能力均被削弱。反之，过表达PACT则能增强TBM II的这些作用。这表明TBM II的抗病毒功效依赖于其对宿主靶点PACT的作用。
9. RIG-I通路是TBM II通过靶向PACT发挥抗病毒作用的关键通路
为了最终确认通路依赖性，研究人员构建了RIG-I、MAVS、IFN-β基因敲除的A549细胞系。在这些关键基因被敲除的细胞中，IAV-H1N1/FM1感染的病毒载量更高，而TBM II降低病毒载量、上调Ifnb1 mRNA及IFN-β蛋白水平的效力则基本丧失。这确凿地证明，TBM II的广谱抗病毒活性完全依赖于其通过靶向PACT来激活RIG-I信号通路，进而增强IFN-β产生和先天免疫这一机制。
归纳研究结论和讨论部分，强调其重要意义
本研究首次报道了靶向宿主蛋白PACT的配体化合物——源自中药土贝母的Tubeimoside II (TBM II)。该化合物能高亲和力、特异地结合于PACT的Thr78位点。其核心机制在于，TBM II通过与PACT结合，促进了PACT与细胞内病毒RNA传感器RIG-I的相互作用，从而激活了RIG-I/MAVS/IRF3信号通路，最终促使I型干扰素IFN-β大量分泌，增强宿主的先天免疫防御能力。基于这一作用机制，TBM II在体外和体内均表现出对多种重要呼吸道病毒（包括SARS-CoV-2、HCoV-OC43和IAV-H1N1）的广谱抑制活性，不仅能降低病毒载量、抑制病毒复制，还能缓解病毒引起的肺部炎症和免疫损伤。
这项研究的重大意义体现在多个层面。首先，它成功验证了PACT作为一个极具潜力的抗病毒宿主靶点的成药性，并提供了首个靶向该蛋白的活性化合物，为针对该靶点的药物研发打开了突破口。其次，研究创新性地将传统中药化合物与前沿的宿主靶向抗病毒策略相结合，不仅为TBM II赋予了新的治疗内涵，也为从传统药物资源中挖掘靶向宿主因子的广谱抗病毒先导化合物提供了成功范例。最后，面对病毒变异快、易耐药的传统挑战，这种通过增强宿主固有免疫来对抗多种病毒的策略，有望带来更广谱、更持久的新型抗病毒药物，为应对未来可能出现的呼吸道病毒疫情储备了有价值的候选药物和靶点基础。尽管针对PACT下游机制的研究不限于RIG-I通路，但本工作无疑为基于“靶点-配体化合物”模式的下一代广谱抗病毒药物开发奠定了坚实基础。
