马苏鲑（Oncorhynchus masou）在向海迁移和回游过程中，嗅觉系统中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的基因表达水平

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Gene expression levels of brain-derived neurotrophic factor in the olfactory system of masu salmon Oncorhynchus masou during both seaward and homeward migrations

该研究通过分离大马哈鱼pro-Bdnf完整编码序列，结合多阶段样本分析发现pro-Bdnf在幼鱼阶段嗅觉轮和球中表达显著升高，尤其在印记行为敏感期，而端脑表达稳定，支持BDNF在嗅觉回路形成与成熟中的作用。

　　

横山淳树|阿部隆|谷本由奈|下田和隆|佐佐木隆文|工藤英明

北海道大学渔业科学学院，日本函馆041-8611

摘要

太平洋鲑鱼（Oncorhynchus属）依靠在其出生河流中获得的嗅觉信息来引导它们的归巢迁徙。尽管与突触可塑性相关的分子在印记相关时期在嗅觉系统中表现出显著变化，但脑源性神经营养因子（BDNF/Bdnf）——一种关键的神经发育和可塑性调节因子——在鲑鱼中的贡献尚未得到充分研究。在这项研究中，我们分离出了马苏鲑鱼（O. masou）pro-bdnf的完整编码序列，并使用多个发育阶段的野生个体分析了其在嗅觉系统中的表达谱。马苏鲑鱼pro-Bdnf的推导氨基酸序列在脊椎动物中高度保守。在幼鲑期（parr阶段），特别是在印记敏感期的嗅觉玫瑰花结和嗅球中，pro-BdnmRNA的表达非常强烈。在相当于哺乳动物大脑的前脑（telencephalon）中，pro-Bdnf的表达在不同阶段保持稳定，这与该区域持续的神经发生一致。这些结果提供了分子证据，表明pro-Bdnf的表达反映了嗅觉系统的发育变化，并支持BDNF有助于形成和精炼对太平洋鲑鱼的印记和归巢至关重要的嗅觉回路的观点。

引言

太平洋鲑鱼（Oncorhynchus属）在早期发育过程中会学习其出生河流的特征性气味特征，如氨基酸组成。当它们作为成年鱼从海洋返回时，它们主要依靠嗅觉线索来定位它们起源的同一条河流（Hasler和Scholz，1983；Dittman等人，1996；Shoji等人，2000；Bett和Hinch，2016）。这种归巢能力被认为依赖于幼年时期获得的气味信息的长期保留（Ueda，2019）。这种嗅觉记忆的获取和检索涉及神经可塑性，这是一个广义术语，描述了神经系统根据经验修改其结构和功能的能力（Voss等人，2017）。在鲑鱼中，与记忆和大脑成熟相关的神经化学和分子标志物在幼鲑期到成熟期的转变期间发生了显著变化。例如，银鲑（O. kisutch）在这一时期显示出几种神经递质系统的水平增加（Ebbesson等人，1992，Ebbesson等人，1996），而狗鲑（O. keta）在向海洋迁移时表现出N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-d-aspartate receptor）的nr1亚基的表达升高（Ueda等人，2016）。我们小组之前的研究表明，在被认为对印记和随后的记忆检索至关重要的时期，与突触囊泡释放相关的转录本，包括可溶性N-乙基-马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE/Snare）复合体和突触生理素（synaptophysin）的成分，在嗅觉系统中增加（例如，Abe和Kudo，2019，Abe等人，2022；Ogihara等人，2024）。

脑源性神经营养因子（BDNF/Bdnf）是另一种与神经发育和可塑性密切相关的分子（例如，Lu，2003）。通过激活其受体TrkB，BDNF调节多种过程，如神经元存活、树突生长和突触形成（Huang和Reichardt，2001；Park和Poo，2013）。将BDNF注入成年大鼠（Rattus norvegicus）的齿状回（dentate gyrus）可以增加神经发生和异位颗粒细胞（Scharfman等人，2005）。BDNF敲除小鼠（Mus musculus）在恐惧条件测试中表现出学习能力受损，并且海马体缺乏长期增强作用（Monteggia等人，2004）。在鲑鱼科（Salmonidae）中，BDNF mRNA的表达已被用作虹鳟（O. mykiss）中应激诱导的神经可塑性的指标（Johansen等人，2012），以及用于评估孵化场饲养的大西洋鲑鱼（Salmo salar）幼鱼的环境丰富度的指标（Mes等人，2019）。在鲑鱼的感官器官中，只有关于蛋白质水平的详细数据（Western-blotting和免疫组化），在机械感受器、侧线系统（Germana等人，2002）和内耳（Catania等人，2007）中有所报道。然而，BDNF/bdnf在鲑鱼嗅觉印记机制中的作用仍然大部分未解决。此外，由于缺乏全长cDNA信息，鲑鱼BDNF的完整一级结构尚未确定。

鲑鱼的嗅觉系统包括外围组成部分，如嗅觉玫瑰花结和上皮，以及中枢区域，如嗅球（OB）和前脑（Tc）。气味刺激首先由位于嗅上皮中的受体神经元检测到，那里持续的神经发生为新分化的细胞提供替换（Yanagi等人，2004）。这些神经元的轴突在嗅球（OB）汇聚（Kudo等人，1996），在那里信号被初步处理，然后传输到包括前脑（Tc）在内的更高脑中心（Ochs等人，2017）。由于这些区域协调气味信息的获取和解释，嗅觉系统内的经验依赖性变化可能在印记和出生河流辨别中起重要作用。

马苏鲑鱼（O. masou）是远东特有的原始Oncorhynchus物种，与虹鳟（Murata等人，1996）一起，具有复杂的生活史。在日本北海道的马苏鲑鱼的生活史与其他日本鲑鱼物种（如狗鲑和粉鲑O. gorbuscha）明显不同（Kato，1991）。孵化并在淡水河流中出现后，个体在河流环境中停留超过一年，然后经过一个独特的幼鲑期（PST）后作为幼鲑迁移到海洋。在一些生长迅速的雄性中，会出现另一种生活史策略，即它们提前成熟并留在淡水中而不向海洋迁移。进入海洋后，马苏鲑鱼通常生长大约一年，然后在春季和夏季繁殖季节返回它们的出生河流，这比狗鲑和粉鲑的返回时间要早。在秋季完成性成熟之前，它们会在淡水中停留几个月。存在体型相似的迁徙型（海生）和定居型（提前成熟）雄性，为比较神经基因表达的发育谱提供了有用的框架。此外，与其他鲑鱼物种相比，马苏鲑鱼表现出更高的归巢准确性和更低的偏离非出生河流的比率（Miyakoshi等人，2012）。

为了阐明BDNF在嗅觉系统中的表达变化及其在印记或记忆检索中的潜在作用，我们使用野外收集的野生马苏鲑鱼在多个发育阶段检测了pro-bdnmRNA的水平。

章节片段

动物

2019年至2021年间收集了代表多个发育阶段的野生马苏鲑鱼（表1）。春季从Yurappu河（42°17′34.5”N，140°08′03.4″E）采集了0⁺龄（幼鲑期）parr、1⁺龄（一年生）parr和1⁺龄幼鲑。夏季从同一条河流中采集了提前成熟的雄性和最近完成归巢迁徙的成年雄性。不成熟的摄食期个体则从Kumaishi沿海地区（42°06′12.6”N）采集。

马苏鲑鱼pro-bdnf的核苷酸序列分析

对马苏鲑鱼bdnf的RT-PCR扩增子进行了测序。获得了包含整个编码区域的bdnf的完整编码序列（CDSs）（LC779547）。通过连续PCR和对产物的序列分析，获得了包含整个编码区域的pro-bdnf cDNA，该cDNA由1019个核苷酸组成。推导出的氨基酸序列对齐显示在图1中。马苏鲑鱼pro-Bdnf的推导氨基酸序列有99%的

讨论

BDNF主要在谷氨酸能神经元中以前体形式（pro-BDNF）表达，然后被加工成N端前肽和C端成熟BDNF。在人类中，成熟BDNF由119个残基组成，分子量为13.5千道尔顿（Lessmann和Brigadski，2009）。成熟BDNF与TrkB受体结合，并在神经细胞的存活和分化中起作用。马苏鲑鱼的成熟BDNF与其他BDNF分子高度同源，被认为是一种

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CRediT作者贡献声明

横山淳树：写作——原始草稿、研究、数据管理。阿部隆：方法学、数据管理、概念化。谷本由奈：可视化、验证、研究。下田和隆：资源。佐佐木隆文：资源、概念化。工藤英明：写作——审阅与编辑、监督、资金获取。

资助

这项研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究补助金（C类）（编号：23K05380）和JSPS日本顶尖研究大学培养计划（J-PEAKS）（资助编号：JPJS00420230001）的支持。

未引用的参考文献

Satou, 1990

Takami和Nishiyama, 2008

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务或非财务利益冲突，这些利益可能会影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢Oshima鲑鱼繁殖协会提供来自Yurappu河的幼鱼和成熟鱼，以及前Donan研究分部的研究员小林道司先生和青山智也先生提供的成熟鱼。作者还感谢小原淳先生在涉及qPCR的实验室工作中提供的帮助。