淡水珍珠贝（Hyriopsis cumingii, Lea, 1852）中类胡萝卜素裂解加氧酶基因的功能分析

《Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology》：Functional analysis of carotenoid cleavage oxygenase genes in freshwater pearl mussel ( Hyriopsis cumingii, Lea, 1852)

类胡萝卜素代谢酶HcBCO1和HcBCO2在淡水珍珠贝贝壳颜色形成中的作用及其功能差异研究。

　　

王志岩|严玲|刘春同|卢婷婷|张敏|张瑶|陈阳|白志毅

农业农村部淡水水生遗传资源重点实验室，上海海洋大学，上海201306，中国

摘要

β-胡萝卜素-15,15-双加氧酶（BCO1）和β-胡萝卜素-9,10-双加氧酶（BCO2）是催化类胡萝卜素氧化裂解的关键酶，在类胡萝卜素稳态和色素沉着中起重要作用。本研究从淡水珍珠贝Hyriopsis cumingii中鉴定出HcBCO1和HcBCO2，以探讨它们在类胡萝卜素代谢和贝壳珍珠层颜色形成中的潜在作用。HcBCO1包含一个1560 bp的开放阅读框（ORF）、一个171 bp的5’非翻译区（5’ UTR）和一个171 bp的3’非翻译区（3’ UTR），而HcBCO2包含一个1590 bp的ORF、一个3 bp的5’ UTR和一个394 bp的3’ UTR。qRT-PCR结果显示，HcBCO1和HcBCO2在所有检测组织中均有表达，其中白色贝壳品系的表达水平显著高于紫色和金色品系。通过原位杂交（in situ hybridization）检测发现，HcBCO1和HcBCO2在贝壳的外层（OF）、中层（MF）、内层（IF）和腹侧外套膜（VM）中均呈现强烈的阳性信号。进一步的功能分析表明，重组的HcBCO1和HcBCO2在大肠杆菌（E. coli）中能够裂解β-胡萝卜素，其中pGEX-4T-HcBCO1组表现出更强的裂解能力。此外，双链RNA干扰（dsRNA interference）实验表明，抑制HcBCO1/HcBCO2的表达可增加外套膜中的类胡萝卜素积累。我们的结果表明，HcBCO1和HcBCO2均具有裂解类胡萝卜素的能力，其中HcBCO1的活性更强。本研究为双壳类动物贝壳颜色的多样性提供了新的见解，并为通过调节类胡萝卜素代谢来改善珍珠颜色提供了潜在的分子标记。

引言

淡水珍珠贝Hyriopsis cumingii原产于中国，是全球淡水珍珠产业中的关键物种，占全球珍珠产量的70%以上（Bai等人，2015年）。该物种能产出白色、紫色、粉色和黄色等多种颜色的珍珠，显示出其在彩色珍珠产业中的潜力。然而，Hyriopsis cumingii中珍珠层和珍珠颜色的分子机制尚不清楚（Wang等人，2025年）。研究表明，类胡萝卜素、黑色素和卟啉等色素在贝壳颜色形成中起关键作用，尤其是类胡萝卜素与珍珠层颜色密切相关（Williams，2017年）。例如，具有紫色和金色内壳的Hyriopsis cumingii外套膜组织中的总类胡萝卜素含量（TCC）显著高于白色贝壳个体（Li等人，2014年；Zhang等人，2022年），补充β-胡萝卜素或虾青素可以显著增强内壳和珍珠的颜色（Lu等人，2022年；Sun等人，2020年）。其他双壳类动物的研究也证实了类胡萝卜素在贝壳颜色形成中的关键作用。例如，在珍珠蚝（Pinctada fucata martensii）的珍珠层中检测到了 violaxanthin类胡萝卜素，其中金色品系的含量更高（Wang等人，2022年）。类似地，类胡萝卜素也被认为是其他双壳类动物贝壳颜色多样性的重要因素，如太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、Yesso扇贝（Patinopecten yessoensis）、Bay扇贝（Argopecten irradians irradians）、马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）和硬蛤（Meretrix meretrix）（Maoka等人，2010年；Wan等人，2022年；Zhao等人，2017年；Zheng等人，2010年）。这些研究强烈支持探索类胡萝卜素代谢和积累与Hyriopsis cumingii及其他双壳类动物贝壳珍珠层颜色形成之间的分子机制。

大多数动物无法从头合成类胡萝卜素，必须通过饮食获取。类胡萝卜素在小肠中被吸收后，通过乳糜微粒（chylomicrons）运输到肝脏进行代谢，随后通过血液主要通过脂蛋白介导的运输分布到外周组织（Yonekura和Nagao，2007年）。在组织中，类胡萝卜素具有多种生理功能，如抗氧化、维生素A合成和色素调节（Rao和Rao，2007年；Wade等人，2017年）。这些复杂的生理过程需要多种功能蛋白，如清除受体B类1型（SCARB1）、Niemann–Pick C1样蛋白1（NPC1L1）和簇决定因子36，这些蛋白参与类胡萝卜素的吸收（Reboul和Borel，2011年）；载脂蛋白B和微粒体甘油三酯转移蛋白，它们介导乳糜微粒的运输（Costabile等人，2016年；Li等人，2014年）；以及β-胡萝卜素-15,15-双加氧酶（BCO1）和β-胡萝卜素-9,10-双加氧酶（BCO2），这些酶是类胡萝卜素代谢和转化的关键酶（Lei等人，2016年；Leung等人，2009年；Lietz等人，2012年；Martinez等人，2022年；Tian等人，2010年）。其中，BCO1和BCO2在类胡萝卜素代谢中尤为重要，影响维生素A的产生和动物的色素沉积。尽管这两种酶都参与类胡萝卜素代谢，但它们在底物特异性、催化活性、裂解位点和生物学作用方面存在显著差异（Lietz等人，2012年；Martinez等人，2022年）。BCO1主要催化前维生素A类胡萝卜素（包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素和β-隐黄质）在15,15′-双键处的对称裂解，生成视黄醇类物质。相比之下，BCO2的底物特异性更广，可以不对称地裂解前维生素A类胡萝卜素和非前维生素A类胡萝卜素，产生具有多种生物功能的类胡萝卜素衍生物（Martinez等人，2022年；Mein等人，2011年）。BCO1和BCO2的活性和表达与类胡萝卜素衍生物色素的色素调节密切相关。许多研究表明，BCO1和BCO2序列或表达的变化会改变类胡萝卜素的代谢效率，从而影响色素表型的多样性（Berry等人，2009年；Costabile等人，2016年；Helgeland等人，2014年）。在果蝇（Drosophila）中，BCO1（在昆虫中称为NinaB）的突变会破坏类胡萝卜素代谢，影响维生素A前体的合成，并导致视力缺陷（von Lintig等人，2001年）。在人类、鸡和小鼠中的研究表明，BCO1突变显著影响类胡萝卜素代谢和组织中的类胡萝卜素浓度（Li等人，2017年；Praud等人，2017年；Widjaja-Adhi等人，2015年）。此外，关于牛、羊和鸡的“黄色脂肪”表型的遗传学研究强调了BCO2在调节组织间类胡萝卜素稳态中的关键作用（Berry等人，2009年；Eriksson等人，2008年；Vage和Boman，2010年）。

相比之下，关于水生动物中BCO基因的研究相对较少，其背后的机制尚不完全清楚。Helgeland等人（2014年）首次在大西洋鲑鱼中鉴定出五个同源的BCO基因，后续研究证实beta-胡萝卜素加氧酶1样基因（bco1l）是鲑鱼肉色素沉着的关键基因（Helgeland等人，2019年）。在甲壳类动物中，BCO1是蟹肝胰腺中β-胡萝卜素沉积的中心调控因子（Zhang等人，2024年）。在双壳类动物中，对Yesso扇贝的研究表明，PyBCO样1（PyBCO1）和PyBCO2能够裂解类胡萝卜素（包括pectenolone和pectenoxanthin），确定它们是负责adductor肌肉橙色表型的关键基因（Li等人，2019年；Liu等人，2024年）。在珍珠蚝（P. fucata martensii）中，初步研究发现BCO1基因与TCC存在遗传关联（Lei等人，2019年）。这些发现突显了BCO基因在多种水生动物类胡萝卜素代谢和色素沉着中的关键作用。了解这些酶之间的相互作用不仅有助于阐明色素形成的遗传基础，还为旨在提高类胡萝卜素衍生营养含量或鲜艳颜色的选择性育种计划提供了宝贵见解。

鉴于BCO基因在水生动物类胡萝卜素代谢和色素沉着中的作用，对其的研究有望为彩色淡水珍珠贝的培育提供新的分子见解。在本研究中，我们从Hyriopsis cumingii基因组中克隆了HcBCO1和HcBCO2的全长cDNA序列。利用qRT-PCR和原位杂交技术，分析了这些基因在三种内壳颜色品系（白色、金色和紫色）中的组织特异性表达模式及其在外套膜边缘组织中的定位。我们还在经过改造以合成β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中验证了BCO1和BCO2的类胡萝卜素裂解能力。最后，我们进行了体内RNAi实验，探讨了这些基因对TCC的影响，并比较了两种基因的裂解活性差异。本研究首次探讨了淡水珍珠贝中这两种类胡萝卜素裂解酶的差异，推进了我们对双壳类动物类胡萝卜素代谢的理解。

样本收集

本研究使用了三种具有不同内壳颜色表型的育种珍珠贝品系（白色、金色和紫色）。所有幼贝的平均壳长为8.0厘米（约6个月大），来自中国安徽省桐陵市东联村的一个商业珍珠贝养殖场。这些幼贝在室内实验室条件下适应了7天后（充气去氯淡水；温度22±1°C；溶解氧>5.0 mg/L；pH 7.0–8.5；氨-N<0.4 mg/L），

HcBCO1和HcBCO2的分子克隆和生物信息学分析

利用5′/3′ RACE方法，鉴定并表征了Hyriopsis cumingii的HcBCO1和HcBCO2的全长cDNA。HcBCO1 cDNA长度为1831 bp（GenBank: OQ547810），具有100 bp的5’ UTR、171 bp的3’ UTR和1560 bp的ORF。它编码一个由519个氨基酸组成的蛋白质，包含一个RPE65结构域（194–1648 bp），没有信号肽（图1A）。亮氨酸是最丰富的氨基酸，占组成的8.3%。HcBCO2 cDNA长度为1987 bp（GenBank: OQ547811），

讨论

双壳类动物贝壳和珍珠颜色的多样性一直是生物学研究的长期关注焦点，研究表明其与关键色素因子（包括类胡萝卜素）密切相关（Vershinin，1996年；Williams，2017年）。BCO1和BCO2属于类胡萝卜素裂解加氧酶（CCO）基因家族，是类胡萝卜素代谢中的关键酶，在脊椎动物的营养和色素沉着中起重要作用（Lei等人，2016年；Lietz等人，2012年；Martinez等人，2022年）。

CRediT作者贡献声明

王志岩：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件使用、方法学设计、资金获取、数据分析、数据管理。严玲：初稿撰写、监督、实验设计、数据分析、数据管理。刘春同：初稿撰写、资源提供、实验设计、数据分析。卢婷婷：验证、软件使用、资源提供、数据管理。张敏：可视化、软件使用、方法学设计、数据分析。张瑶：软件使用，

利益冲突声明

所有作者均未披露任何相关利益关系。

致谢

本研究得到了上海市农业委员会人才培养项目（T2025108）、上海海洋大学青年教师创业基金会、国家重点研发计划（2022YFD2400105）、国家自然科学基金（32503175）、中国博士后科学基金一般项目（2024M761925）以及中国农业研究系统专项基金（CARS49）的支持。