微塑料（MPs）被丁香假单胞菌（P. syringae）生物膜定植显著增强其冰核活性：对大气云微物理过程的潜在影响

《Environmental Science & Technology》：Colonization of Microplastics by Different Strains of Pseudomonas Syringae Increases Ice-Nucleation Activity

这篇研究性文章深入探讨了微塑料（MPs）作为一种新兴的大气冰核粒子（INPs）的潜力。文章核心发现，未经生物定植的微塑料（0.5-100 μm）本身具有一定冰核活性（INA），中位冻结温度在-21.0 °C至-23.8 °C之间，而老化处理（水热、UV）对其INA影响不显著。然而，当不同菌株的丁香假单胞菌（P. syringae）在其表面形成生物膜后，能显著将中位冻结温度提升约6.5 °C（p<0.0001），其活性甚至超过了等量悬浮的细菌细胞。该研究强调了经环境老化和微生物定植改造的、更具大气相关性的微塑料，其冰核活性显著提升，揭示了一种被低估的、微塑料可能影响云微物理过程和全球气候的潜在途径。

　　

引言：大气中的微塑料与冰核过程

微塑料（MPs）是尺寸小于5毫米的塑料颗粒，已广泛分布于包括大气在内的整个生物圈，甚至在偏远地区的云水、冰雹和降水中也被检出。这表明微塑料可能扮演着冰核粒子（INPs）的角色，即在较高温度下催化水冻结的粒子。冰核粒子的存在会改变云中液态水与冰的比例，进而影响地球的辐射平衡和整体温度。近期模型研究甚至推测，在热带地区，微塑料可能占冰核粒子的40%。然而，现有估计主要基于城市道路排放源，当考虑所有排放源时，微塑料的作用可能更大。因此，迫切需要研究微塑料在大气冰核过程中的作用，及其对云形成和辐射收支的潜在影响。

先前研究已检验了不同形状、尺寸和类型微塑料的冰核活性（INA），包括聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）等。一旦进入大气，微塑料会经历光氧化等老化过程，改变其表面化学性质。此外，微生物会定植于微塑料表面形成“塑料圈”（plastisphere），改变其表面特性，进而可能影响其传输。冰核活性常与生物冰核剂相关联。例如，有研究表明纺织品表面的生物材料贡献了其冰核活性。这凸显了研究生物膜形成对微塑料表面冰核能力影响的重要性。

本研究以丁香假单胞菌（P. syringae）为模型生物，该菌的一些已知菌株能在微塑料上定植并形成生物膜。我们假设环境老化过程和生物膜形成会增加微塑料的冰核活性。为验证此假设，我们使用具有冰核活性（ice+）和因缺失InaZ基因而缺乏冰核活性（ice-）的丁香假单胞菌菌株TLP2，在原始及老化的100 μm PS和PE微塑料球上进行培养。具体目标包括：（1）对微塑料进行UV或水热处理以实现老化；（2）在老化及原始的PE和PS微球表面培养丁香假单胞菌生物膜；（3）对处理后的微塑料进行液滴冻结实验；（4）评估老化和生物膜形成如何影响微塑料的冰核活性。

材料与方法

微塑料的选择与老化

实验使用了多种尺寸（0.5 μm, 1 μm, 2 μm, 6 μm, 10 μm, 100 μm）和表面修饰的聚苯乙烯（PS）微球，以及100 μm的聚乙烯（PE）微球。所有微球在接收时被视为原始状态。选择PS和PE是因为它们均在大气样品中被检测到，并且在初步测试中能支持所用细菌菌株稳定的生物膜附着。

老化处理模拟了环境风化条件。UV老化是将100 μm的PS和PE微球在定制的老化室中，用15 W的UVC灯（260–280 nm波长）连续照射三天。水热老化则是将0.5–10 μm的PS微球在240 °C下高压灭菌15分钟。通过扫描电子显微镜（SEM）验证了老化导致的表面改性。

在微塑料上培养生物膜

分别将丁香假单胞菌TLP2野生型（ice+）及其同基因突变体（ice-）接种到含有100 μm微塑料的培养基中。经过稀释、共培养、定期更换培养基等步骤，培养72小时以在微塑料表面形成成熟的生物膜。

收获带有生物膜的微塑料

培养结束后，通过过滤收集微塑料，一部分用戊二醛固定用于成像，另一部分通过超声处理将生物膜从微塑料表面剥离，并进行连续稀释涂板，以计算菌落形成单位（CFU），定量生物膜的量。

液滴冻结实验

采用改进的Vali液滴冻结法进行测定。将12 μL包含样品（微塑料悬液）和荧光素钠盐染料的液滴置于96孔板中，孔板漂浮在冷却浴上。温度从0 °C开始，以1 °C为间隔逐步降低，每稳定2分钟计数一次冻结（变为橙色）的液滴数，直至-25 °C（仪器下限）。通过记录每个温度下的冻结液滴数，计算累积冻结分数F(T)，进而计算单位体积活性成核位点的累积密度K(T)。为排除背景冻结影响，计算了K_sample(T) = K(T) – K_background(T)，并将其归一化到微塑料的质量，得到单位质量的活性位点数n_m(T)（g^–1）。中位冻结温度（T₅₀）用于比较不同处理间的冰核活性。

生物膜的成像

通过扫描电子显微镜（SEM）观察并验证微塑料表面生物膜的形成情况。

结果

原始与老化微塑料的冻结

原始和老化微塑料的冰核活性结果显示为箱线图。老化处理改变了50%液滴冻结的温度，其变化方向和幅度因颗粒类型而异。具体而言，部分表面修饰的1 μm和2 μm PS微球老化后中位冻结温度略有升高（最高+0.5 °C），而0.5 μm PS、100 μm PS和100 μm PE则显示降低。然而，当按聚合物类型分组时，原始与老化的PS或PE颗粒间的冰核活性无统计学显著差异。相比之下，聚合物种类本身对冰核活性有显著影响，PE的冻结温度比PS高近2 °C（p = 0.015）。在活性成核位点数量方面，结果不一。多数微塑料在超过-17 °C后活性降低。

微塑料尺寸对冰核的影响

微塑料尺寸与中位冻结温度的关系显示，100 μm颗粒的冻结温度最暖（-22.8 °C），其次是2 μm、10 μm、1 μm、6 μm，0.5 μm最冷（-23.9 °C）。冻结温度与颗粒尺寸之间未发现显著差异。然而，单位质量的冰活性位点密度n_m随颗粒尺寸减小而增加。m(T)与颗粒尺寸的关系。">

带有生物膜的微塑料的冻结

通过CFU计数估算生物膜在微塑料表面的积累量。ice-菌株在PS、UV老化PS（PSUV）和UV老化PE（PEUV）上的丰度是ice+菌株的10倍。然而，CFU数量本身并非更高中位冻结温度的明确指标。

为评估生物膜定植是否转化为可测量的冰核活性变化，我们比较了定植与未定植微塑料的冻结温度。正如预期，用野生型ice+丁香假单胞菌定植的微塑料，其冻结温度相比未携带ice+菌株的微塑料有统计学上的显著升高。令人惊讶的是，微塑料上的ice+生物膜的中位冻结温度，甚至高于从微塑料上剥离下来的等量（平均10⁵个/mL）悬浮细菌本身。这表明，附着在微塑料表面的ice+细菌可能比悬浮在水中时是更有效的冰核剂。

用突变体ice-菌株定植，普遍趋势是将中位冻结温度提高了约1至2 °C，但仅有在原始PS上的定植具有统计学显著性（p = 0.015），将中位冻结温度从-23 °C提高到-21 °C。然而，当比较ice-生物膜微塑料和等量（平均10⁶个/mL）悬浮ice-细胞时，中位冻结温度存在显著升高（p < 0.0001）。这表明，即使是缺乏固有冰核活性的细胞，其表面附着也能增强冰核效率。

无论是ice+还是ice-丁香假单胞菌菌株，都增加了在较暖温度下可用的活性成核位点数量，从而提高了微塑料的冰核活性。m。">

为了更好地代表同时包含ice+和ice-细菌的天然生物膜，我们平均了两个菌株的冰核活性数据。平均定植使微塑料的中位冻结温度发生了统计学上的显著升高（p < 0.0001）。

讨论

生物膜覆盖的微塑料表现出改变的冰核活性，这一发现从根本上拓宽了我们对微塑料环境和气候作用的理解。微塑料不再被视为惰性环境污染物，而是作为动态基质，不仅容纳微生物生命，还积极塑造着云形成和降水的物理过程。

本研究中微塑料的冻结结果与先前研究发现基本一致，均显示悬浮的微塑料相比纯水能引起冻结温度的正向偏移。然而，关于老化如何影响微塑料作为冰核粒子倾向的结果存在冲突。部分研究（包括本研究发现），各种形式的老化对冰核活性几乎没有影响。而另一项研究发现环境压力可显著增强原始微塑料的冰核活性。这些差异可能源于老化技术类型、微塑料来源、聚合物类型和颗粒形状的不同。

我们未观察到微塑料尺寸对冰核活性有显著影响，这与Busse等人的结果一致。但在量化单位质量微塑料的活性位点密度时，我们的结果不同：Busse等人未观察到明显趋势，而我们发现随着微塑料尺寸减小，可用活性位点数量增加。我们的发现支持经典冰核理论，即活性位点密度随颗粒的表面积与体积比增加而增加。

冰核细菌在微塑料表面栖息时可能是更有效的冰核剂。据我们所知，Teska等人首次报道了微塑料表面的生物膜可显著改变其冰核活性。然而，该研究未比较微塑料上生物膜与单独悬浮细菌的冰核活性。我们的研究发现，从微塑料表面回收的平均数量的ice+丁香假单胞菌细胞，其自身的中位冻结温度低于附着有相同数量细胞的微塑料。这表明ice+细菌附着在微塑料表面时，可能比悬浮在水中更有效地作为冰核剂。同样，ice-细胞也存在类似现象。这支持了表面介导的细胞组织或限制可能促进冰核过程的观点。当丁香假单胞菌附着在微塑料表面时，多种协同机制可能潜在地将其冰核活性提升到超过自由悬浮状态所观察到的水平。

本研究首次报道了生物非冰核剂改变微塑料冰核活性的能力。虽然ice-生物膜对PE、PEUV和PSUV的影响未被认定为统计学显著，但其存在仍将中位冻结温度提高了1至2 °C。而在PS上，ice-菌株的定植则显著提高了中位冻结温度。值得注意的是，ice-在PS上存在的细胞数量更高，这表明大量的生物膜形成可以影响并最终增强微塑料的冰核活性。由于尺寸原因，大多数细菌在高浓度时都有可能作为成核的前体。此外，最近通过从头计算发现，当细菌与无机材料相互作用时，产生的氢键可导致更轻松和更稳定的成核。总体而言，这表明与无机表面结合的细菌可以引发异相成核。

将表面带有生物膜的微塑料与其他已知冰核剂进行比较，其冻结范围与火山灰、矿物尘、海盐气溶胶等类似，同时也与纺织品上的生物膜重叠。这凸显了进一步研究不同微塑料聚合物和形状的冰核潜力，以及有机和无机表面涂层如何影响其活性的必要性。

尽管大气中的微塑料浓度可能远低于本文测试浓度，但实验室故意提高了负载量以确保每个液滴中颗粒的可重复包含。目前缺乏的关键参数是了解大气中微塑料表面存在多少有机或无机物质。大量文献记载了陆地和水生环境中“塑料圈”的存在，并且许多研究表明微塑料会吸附其他污染物。很可能许多在大气中传输的微塑料表面都带有有机和/或无机物质。除了影响传输路径，微塑料表面的这些额外“杂质”可能改变微生物定植和冰核潜力。目前关于大气微塑料的文献主体尚未保留这些属性，因为微塑料通常经过过氧化物消解以去除表面有机物质进行光谱鉴定。因此，未来的研究应力求保留收集的大气微塑料子集，以进一步研究其表面成分。

除了减少模型不确定性，了解空气传播微塑料表面存在哪些生物体，也可能为疾病追踪和监测提供见解。然而，目前尚不清楚大气微塑料生物膜在病原体和抗生素抗性基因含量方面与其他环境相比如何。这进一步凸显了直接研究从大气中收集的微塑料上微生物群落的必要性。

本研究存在若干局限性。首先，由于仪器限制，冻结监测仅至-25 °C，捕获了冻结谱的起始和中位部分，但未包括更冷温度下的成核。其次，我们使用了球形PS和PE微球以控制表面积并确保可重复的生物膜附着，而环境中的微塑料通常不规则且粗糙。第三，环境相关的大气微塑料浓度极低，本文使用了更高的颗粒负载量以确保液滴内颗粒的可重复包含。第四，UVC照射被用作加速老化处理，这是一种极端情况，并不代表以UV-A和UV-B波长为主的自然大气暴露。最后，生物膜不规则的三维结构阻碍了对其增加表面积的精确量化。尽管存在这些限制，我们的结果揭示了生物膜驱动的微塑料冰核活性改变，并为未来的大气研究提供了基础。

随着全球塑料产量持续上升，大气中的微塑料负荷预计也将增加。结合气候变化的加速效应，这可能会加剧塑料降解，并进一步提升微塑料的释放和大气传输。本研究为不断增长的证据做出贡献，证明微塑料在一系列聚合物类型和尺寸下，都能在浸润冻结条件下充当异相冰核粒子。值得注意的是，我们表明生物膜定植通过增加活性成核位点的数量，特别是在较暖温度下，增强了它们的冰核活性。

这些发现强调了在未来实验室分析和大气冰核粒子模型中纳入环境相关的微塑料（包括那些带有有机涂层或微生物群落的）的重要性。理解微塑料在大气中的作用仍处于早期阶段。通过展示表面相关生物学如何改变其冰核潜力，这项工作有助于弥合微塑料在环境中的存在与其可能的气候影响之间的关键差距。需要持续研究来表征微塑料在聚合物、形状和表面化学方面的巨大多样性，以及它们所承载的复杂动态的生物膜群落，以更好地理解这些不断演变的材料如何与云微物理过程相互作用。