一种用于血液和尿液单糖定量分析的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）方法的建立与应用

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Quantification of Monosaccharides in Blood and Urine by HPAEC-PAD

本研究建立并验证了一种高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）方法，首次实现了血浆、红细胞和尿液中葡萄糖、果糖、塔格糖及半乳糖四种膳食单糖的同时、可靠定量。该方法为研究糖替代品（如塔格糖）的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）以及血糖控制提供了有力的分析工具。

　　

引言

高血糖，尤其是糖尿病中的高血糖，会导致心血管疾病、肾病、神经病变、视网膜病变等严重健康并发症。因此，良好的血糖控制和血糖水平监测对降低糖尿病并发症风险至关重要。与此相关的，是患者对富含碳水化合物食物的血糖指数（GI）的认知。无论是血糖控制还是GI计算，生理样本中的葡萄糖分析都必不可少且已成熟建立。然而，生理样本中需要关注的不仅是葡萄糖的定量。糖替代品，如塔格糖（果糖的C4-差向异构体），被讨论作为葡萄糖、果糖或蔗糖的替代品。塔格糖不会导致健康受试者和2型糖尿病患者血浆和血清中餐后葡萄糖水平的变化，并导致2型糖尿病患者的糖化血红蛋白（HbA_1c）水平下降。然而，塔格糖的代谢命运仅基于其与果糖的结构相似性进行推测。因此，研究塔格糖和其他糖替代品作为替代甜味剂的潜力的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）研究也需要在血浆、红细胞和尿液等生理样本中进行可靠的糖分析。

目前有几种定量生理样本中糖类的方法。酶法是血清或血浆中葡萄糖最常用的方法，使用己糖激酶（EC 2.7.1.1）或葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）。酶法也用于定量生理样本中的果糖和半乳糖。通过组合合适的酶，可以同时定量两种不同的糖。酶法的优势在于其特异性和灵敏度，可以分析更复杂的样品。然而，这些方法受到合适酶可用性的限制，并且在同时定量两种以上糖方面能力有限。

气相色谱，特别是与质谱联用（GC-MS），提供了高灵敏度和高分辨率。它允许同时分析和定量糖和糖醇。然而，样品需要衍生化，例如肟化和硅烷化，以将糖转化为挥发性和稳定的衍生物，还需要脱蛋白和脱脂。塔格糖也可以通过GC-MS定量。然而，由于生理样本中含有大量的葡萄糖，用GC-MS同时定量不同的单糖可能具有挑战性。葡萄糖与分子量相似的衍生化合物（如其他己糖如果糖、半乳糖或塔格糖）的保留时间差异很小，这导致峰重叠或共洗脱。这些样品的质谱图非常相似，差异很小，主要与碎片强度有关。

糖分析的另一种方法是高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）。这里利用了糖类的弱酸性，在pH值高时会去质子化。该技术的优势在于高灵敏度、可同时分析不同类别的碳水化合物（单糖、二糖、寡糖、多糖和糖醇）、相对简单的样品制备（无需衍生化），以及由于脉冲安培检测所用条件而对碳水化合物有相对选择性的检测。目前，仅有少数已发表的研究涉及使用HPAEC-PAD分析生理样本中的糖，主要用于定量尿液和血浆中的甘露醇、鼠李糖、木糖、3-O-甲基葡萄糖和乳果糖，因为它们用于无创研究肠道黏膜的主动和被动运输。一家制造HPAEC设备的公司的应用说明描述了分析合成尿液中半乳糖、葡萄糖、蔗糖、核糖和乳糖的方法。Seo等人开发了一种定量血清中半乳糖和葡萄糖作为糖尿病和半乳糖血症诊断标志物的方法。Feil和Lunn描述了一种更通用的方法，他们开发了通过HPAEC-MS/MS分析各种可溶性糖和糖醇的方案。然而，该方案中的样品制备是多步骤的，需要相对大量的干燥样品，这对于生理样本并不总是可行。

因此，本研究旨在开发一种方法，首次通过HPAEC-PAD定量生理样本（如尿液、血浆和红细胞）中的葡萄糖、果糖、半乳糖和塔格糖。该方法可用于血糖控制、GI测量或糖替代品ADME研究等领域的研究。

材料与方法

化学品

研究中使用的物质均购自商业供应商，包括氯化铵、肌酐、柠檬酸二氢钠、无水氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钠、尿素、d(-)-果糖、d(+)-葡萄糖、d(+)-半乳糖、草酸钾、尿酸、d-塔格糖、三氯乙酸、氯化钠、氢氧化钠溶液、无水硫酸钠、无水乙酸钠等。所有标准溶液、样品和HPAEC-PAD洗脱液均使用电阻率为18.2 MΩ·cm、总有机碳（TOC）含量<5 ppb的超纯水制备。人工尿液根据文献配制。

血液和尿液样本

血液和24小时尿液样本采集自一名健康志愿者（女性，年龄22岁，身体质量指数22.2 kg/m²）。志愿者进行了口服葡萄糖耐量试验（oGTT）、口服果糖耐量试验（oFTT）和口服塔格糖耐量试验（oTTT）。在禁食过夜12小时后，在摄入糖负荷前（0分钟）及之后30、60、90、120和180分钟采集静脉血。oGTT摄入75克葡萄糖溶于200毫升水；oFTT摄入40克果糖溶于200毫升水；oTTT摄入50克塔格糖-半乳糖混合物（59.3% d-塔格糖，40.5% d-半乳糖，≤0.2%乳糖）。血液采集使用肝素锂采血管。24小时尿液在口服耐量试验日（上午9:00至次日上午9:00）收集，弃去首次晨尿。在未进行口服耐量试验且饮食不受限的另一天，以同样方式收集基线尿液。该研究已获得德累斯顿工业大学伦理委员会批准，志愿者签署了书面知情同意书。

血液样本制备

采集血液后，通过离心分离血浆和红细胞。弃去白细胞层，血浆在-80°C保存直至分析。红细胞用等量的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液洗涤三次。红细胞通过加入4倍体积的水裂解，裂解液在-80°C保存。分析单糖时，将样品融化离心。取40 μL血浆或裂解的红细胞加入80 μL三氯乙酸（TCA；5%，w/v）立即混合以沉淀蛋白质。冰上放置10分钟后，离心，取40 μL上清液用水稀释。对于oFTT的0分钟和180分钟红细胞样品，进行了修改：将40 μL上清液用160 μL水稀释。对于oTTT的红细胞样品，所有用于蛋白质沉淀的样品和试剂的体积均加倍，以便能够定量塔格糖。蛋白质沉淀后，样品制备与其他样品相同。样品充分混合，通过注射器过滤器转移至HPAEC进样瓶中。

尿液样本制备

收集24小时尿液后，称重以确定尿量。24小时尿液的所需密度平均为1.01 g/mL。取两份15 mL等分试样在-20°C保存直至分析。融化并充分混合后，取10 μL尿液加入1990 μL水中。样品混合后通过注射器过滤器转移至HPAEC进样瓶中。

血液校准品制备

通过各自标准品的外标法进行定量。血浆和红细胞中单糖的定量使用混合标准品在TCA中进行，浓度范围如下：塔格糖和半乳糖0.1–200 μmol/L，葡萄糖5–400 μmol/L，果糖0.1–40 μmol/L。测试了标准品在TCA中的稳定性，在自动进样器中放置一段时间后未观察到浓度变化。

尿液校准品制备

尿液单糖的定量使用混合标准品在人工尿液中制备。将各标准品的储备液用水稀释，加入10 μL人工尿液，得到标准品浓度范围：葡萄糖和果糖0.1–10 μmol/L，半乳糖0.07–100 μmol/L，塔格糖0.7–100 μmol/L。

血液方法验证

用于方法验证的参数包括：线性、检出限（LOD）和定量限（LOQ）、方法精密度、测量精密度、高浓度和低浓度范围内的回收率。

线性通过Mandel拟合检验评估。检验变量（TV）根据公式1计算，并与显著性水平α = 0.05下自由度为1和N – 3的相应F值（F_0.05,1,N–3）进行比较。零假设H₀（线性回归和二次回归的残差之间无显著差异）在TV > F_0.05,1,N–3时被拒绝。如表1所示，对于红细胞和血浆中的所有分析物，以及尿液中除塔格糖外的半乳糖、葡萄糖和果糖，二次回归模型更适合描述信号与浓度之间的相关性，因为TV > F_0.05,1,N–3。对于尿液中的塔格糖，零假设不能被拒绝，因为TV < F_0.05,1,N–3，这意味着线性和二次回归模型的残差之间没有显著差异。在这种情况下，可以比较确定系数（R²）以决定哪种模型最合适。表1显示，对于红细胞和血浆，二次回归R²更接近1，因此采用二次回归模型。尿液中的塔格糖二次回归R²也优于线性（0.9982 vs 0.9963），因此也采用二次回归模型，以便在不同样品基质中使用相同的回归模型进行评估。

LOD和LOQ分别通过信噪比（S/N）为3和10确定。通过独立制备和测量空腹红细胞和血浆样品六次来确定葡萄糖的方法精密度。由于空腹血样中半乳糖、果糖和塔格糖水平

尿液方法验证

使用与血液相同的验证参数。LOD和LOQ从人工尿液中的分析物确定。方法精密度通过制备标准品混合物并独立测量六次来评估。测量精密度通过连续进样六次标准品混合物来评估。回收率评估同样根据文献进行。

HPAEC-PAD条件

单糖定量采用配备单泵、自动进样器、10 μL进样环和电化学检测器（金工作电极，Ag/AgCl参比电极）的系统。应用碳水化合物四电位波形。使用SweetSep AEX20色谱柱（5 μm，4 mm × 200 mm）及相应的保护柱。洗脱液A为0.9 mmol/L NaOAc + 4.2 mmol/L NaOH，B为250 mmol/L NaOH。分析条件：自动进样器温度10°C，柱温30°C，流速0.6 mL/min。起始条件为100% A，保持15分钟，然后在0.2分钟内切换至100% B，保持15-30分钟作为清洗步骤，然后在0.2分钟内切换回100% A，保持30分钟进行柱平衡。

统计分析

数据以双次测定的平均值±标准偏差表示。使用MS Excel 2010和OriginPro 2021b进行Mandel拟合检验、回归模型评估和方法验证实验的统计分析。

结果与讨论

单糖的鉴定

本研究旨在开发同时定量生理样本中不同单糖的方法。血浆、红细胞和尿液中单糖的色谱图分别展示。通过比较保留时间与标准品对化合物进行鉴定。标准品单独及混合分析时色谱图仅显示一个峰，表明分析过程中没有发生一种糖向另一种糖的异构化。

方法的有效性

所建立的方法根据文献在线性、LOD、LOQ、方法精密度、测量精密度和回收率等方面进行了验证。如表1和表2所示，验证结果表明方法具有良好的选择性、准确度和精密度。对于所有分析物，二次回归模型是最合适的校准模型。LOD和LOQ分别在0.1–5.3 μmol/L和0.4–15.9 μmol/L范围内。在低浓度范围内，三种生理基质中添加的单糖回收率为：红细胞88.8–101.3%，血浆81.8–101.6%，尿液93.5–128.5%；高浓度范围内回收率为：红细胞94.4–105.1%，血浆72.6–109.0%，尿液88.1–94.1%。方法精密度和测量精密度分别在1.3–11.4%和0.3–6.2%之间变化。考虑到生物样本的可变性，精密度标准可放宽至15%，因此所有分析物在三种基质中的精密度均在可接受范围内。

葡萄糖、果糖、塔格糖和半乳糖的血浆水平

使用该方法分析了一名健康志愿者在进行oGTT、oFTT和oTTT后的红细胞、血浆和24小时尿液中的单糖。如图3A所示，oGTT后血浆葡萄糖水平在摄入75克葡萄糖后30分钟内从空腹时的（5.3 ± 0.5） mmol/L升高至（7.3 ± 0.8） mmol/L，并在120分钟后降至基础水平，这与健康受试者的典型oGTT曲线一致，证明了该方法用于血浆葡萄糖分析的适用性。

oFTT后血浆果糖水平在摄入40克果糖后30分钟达到峰值（454 ± 2）μmol/L。这与使用酶法分析的文献报道结果相符。oTTT后（摄入约30克塔格糖和20克半乳糖），血浆塔格糖水平在180分钟内持续升高，最终水平约为（170 ± 10）μmol/L，而血浆半乳糖水平在60分钟达到峰值后下降。血浆塔格糖水平的持续升高与文献报道一致，表明其清除速度较慢。

葡萄糖、果糖、塔格糖和半乳糖的红细胞水平

oGTT后，红细胞葡萄糖水平在60分钟内从（5.1 ± 0.5）轻微升高至（5.6 ± 0.4） mmol/L。空腹红细胞果糖水平为（23 ± 10） μmol/L，oFTT后30分钟显著升高至（412 ± 8） μmol/L，180分钟后降至（68 ± 27） μmol/L。这种升高表明果糖从血浆进入红细胞，这与已知的GLUT5转运蛋白介导的摄取一致。而随后的下降则表明红细胞具有代谢果糖的能力，可能通过己糖激酶途径（亲和力低）或特异的3-磷