《Frontiers in Plant Science》：Evaluation of soybean sprouting growth vigor based on ZnONPs
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本文综述了利用YOLOv8-SEGCAL优化模型与全时序作物生长监测系统，精准评估氧化锌纳米粒子（ZnONPs）对大豆（Zhonghuang 13）种子发芽活力的影响。研究揭示，在特定浓度（600 mg/L）下，ZnONPs分散液可显著提升盐分（NaCl）和干旱（PEG6000）胁迫下种子的发芽率、发芽势和胚根长度。该工作为开发高通量、自动化的作物抗逆性评估与精准育种技术提供了新的理论与方法参考。
引言
大豆作为重要的蛋白质和食用油来源，其生产常受到盐分和干旱等非生物胁迫的严重影响。种子发芽期是作物建成的关键阶段，对矿物质供应高度敏感。近年来，纳米粒子（Nanoparticles）诱导处理被证明能促进种子萌发并提高其在胁迫环境下的发芽潜力。其中，氧化锌纳米粒子（ZnONPs）因其对植物有益的效应，被视为应对多种环境胁迫的潜在有效处理方法。种子活力是评估高质量育种最具代表性的指标之一，传统评估方法常具有破坏性、耗时且依赖主观判断，限制了其通量和准确性。因此，开发高精度、自动化、高通量的方法来评估大豆发芽活力具有重要研究价值。本研究旨在探究ZnONPs对大豆种子萌发的影响，并建立一种精准的评估方法，为在干旱和盐碱环境中改善大豆发芽提供新的见解。
材料与方法
本研究构建了一套全时序作物生长活力监测系统用于实验，该系统由环境控制、图像采集和图像存储三个模块组成。为建立大豆种子发芽图像数据集，研究选用了216粒饱满均匀的中黄13号大豆种子，在25 ± 1°C下进行了96小时的全时序发芽实验，共采集1728张图像。为提高模型鲁棒性，对图像和标签进行了高斯模糊、缩放、旋转、翻转和亮度调整等数据增强处理。
在模型开发方面，研究采用了YOLOv8-Seg实例分割模型作为基础架构。为在检测精度和运行效率之间取得平衡，并对复杂的种子表型空间结构和多尺度特征进行更深层次建模，研究对模型进行了三项优化：1) 用Ghost Convolution（GhostConv）替换传统卷积以减少计算复杂性和参数量；2) 集成Swin Transformer模块，通过窗口化多头自注意力机制增强模型捕获种子微形态等异质特征的能力；3) 添加Squeeze-and-Excitation（SE）注意力机制，以增强模型对细小种子目标的检测性能。优化后的模型称为YOLOv8SEGCAL。
为从分割结果中获取关键生物参数，研究采用了基于轮廓检测的图像处理技术来计算胚根长度。该方法提取根部掩模的外轮廓，通过比例校准将像素单位转换为实际物理距离，并取外轮廓长度的一半作为单株大豆的估计根长（L），以最小化传统直线测量可能带来的系统低估误差。
在机制探究方面，研究假设纳米氧化锌颗粒可以释放锌离子（Zn2+），可能通过参与生长素和吲哚-3-乙酸的合成与积累，在细胞分裂和增殖中发挥作用。在胁迫条件下，锌通过与巯基和磷脂结合，有助于维持大豆细胞膜的稳定性和完整性。
在应用实验设计上，研究首先测试了不同浓度（0, 200, 400, 600, 800, 1000 mg/L）的ZnONPs分散液对大豆种子发芽的影响。基于前期实验结果，筛选出最佳促进浓度600 mg/L，进一步将其与不同浓度的氯化钠（NaCl，模拟盐胁迫）或聚乙二醇6000（PEG6000，模拟干旱胁迫）溶液结合，进行发芽实验，以评估ZnONPs在复合胁迫下的缓解效应。
结果
模型优化
对比实验表明，提出的YOLOv8SEGCAL模型在检测和分割大豆胚根方面优于YOLOv5、YOLOv7和原始YOLOv8模型。其目标检测平均精度（mAPbox50）达到99.4%，分割掩模平均精度（mAPmask50）达到88.5%，均表现出最优性能。与未修改的YOLOv8相比，其检测mAP50-95提升了约2%，分割掩模mAP50-95提升了4%。
根长计算方法验证
将本研究方法估算的根长与人工测量值进行对比，线性回归分析得出的确定系数（R2）为0.978，表明估算值与测量值之间具有高度一致性，斜率接近1，验证了该方法在早期发芽阶段根长评估中的准确性和可靠性。
ZnONPs分散液诱导效应
全时序监测实验结果显示，不同浓度的ZnONPs对作物生长产生了不同影响。其中，600 mg/L浓度处理的大豆种子表现出最高的发芽率（较对照提升28%）和最长的胚根长度（提升42%）。与去离子水对照相比，600 mg/L ZnONPs分散液使种子初始发芽时间提前，发芽率提高，胚根长度增加。相比之下，高浓度（1000 mg/L）处理则显著抑制了发芽和根生长。不同时间点、不同浓度处理下的种子发芽过程图像直观地展示了这种差异。
大豆种子发芽活力测试
在盐胁迫（NaCl）和干旱胁迫（PEG6000）下的应用实验表明，600 mg/L ZnONPs处理能够缓解低浓度胁迫对发芽的抑制。在NaCl胁迫下，ZnONPs处理在无盐（0 mmol/L）和轻度盐胁迫（40 mmol/L）条件下显著提高了种子的发芽率和胚根长度；但在较高盐浓度（≥80 mmol/L）下，这种促进作用变得不显著。总体而言，发芽率和根长均随NaCl浓度升高而显著下降。
在PEG6000模拟的干旱胁迫下，ZnONPs处理在无胁迫和轻度胁迫（2%）下显著改善了发芽率；在低浓度胁迫范围内，ZnONPs处理组的平均根长也显著大于未处理组。然而，随着PEG6000浓度增加，发芽率和根长均呈下降趋势。不同胁迫条件下，有无ZnONPs处理的种子发芽表型对比图像进一步证实了上述趋势。
结论
本研究开发了一个融合增强型YOLOv8模型的高通量监测系统，用于精确评估ZnONPs对大豆种子萌发的促进作用。结果表明，在正常和低胁迫条件下，600 mg/L ZnONPs分散液能显著改善发芽率、加速发芽进程并增加胚根长度。这种增强效应可能与Zn2+离子的持续释放有关，其作为关键酶的辅助因子，可能参与了种子贮藏物质的动员和抗氧化防御。观察到的ZnONPs预处理缓解盐旱胁迫抑制的表现，推测其可能通过调节关键酶（如超氧化物歧化酶SOD）活性、减少氧化损伤等机制，有助于维持细胞膜稳定性。
然而，本研究也存在一定局限性：结论基于单一品种（中黄13）的实验室控制条件；专注于发芽活力的表型评估方法，未包含直接的生理生化测量；改进算法在识别后期发芽阶段根缠绕等复杂场景时可能遇到困难；未评估ZnONPs在土壤生态系统中的累积及其长期环境风险。部分数据子集在统计分析时偏离了方差分析（ANOVA）严格的正态性和方差同质性假设，这也是一个需要注意的局限。
未来研究应在不同大豆基因型和田间试验中验证ZnONPs预处理效果；补充活性氧、抗氧化酶活性和锌离子吸收的测量，以阐明其生理生化机制；研究ZnONPs在农业土壤中的长期归趋及其对土壤健康的影响；并进一步改进算法以适应更广泛的识别场景。尽管存在局限，但本研究提出了一种快速评估和增强种子活力的新颖高效策略。集成的表型组学-深度学习平台为筛选具有改良发芽期胁迫耐受性的作物品种提供了宝贵工具。优化的ZnONPs预处理在实验室环境下对支持中黄13品种在胁迫下的发芽显示出效力，这表明其有潜力作为一种种子处理技术，但需在不同基因型和田间试验中进一步验证，以确认其在实际干旱和盐碱地区的适用性，从而为挑战性气候条件下的可持续大豆生产做出贡献。
